实验一--淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定

本科学生实验报告学号：124120463姓名：学院：生命科学学院专业、班级：12级生物技术班实验课程名称：酶工程实验一教师：吴倩云南师范大学教务处编印实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定一、目的要求1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。二、基本原理（一）淀粉酶产生菌的分离1.菌种的采集①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。2.富集培养①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。3.菌种的分离①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。2.酶活定义：在一定pH5.5、37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。酶活计算公式：酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W）A:样品的OD值(平均值)K:标准曲线的斜率N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000μmolW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）3绘制标准曲线①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。②以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量三、器材1试剂:可溶性淀粉、碘、碘化钾、HCl、柠檬酸、Na2HPO4·12H2O等2培养基:分离、纯化培养基3仪器:①平皿、三角瓶、大试管、1mL和10mL移液枪、涂棒；②天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。四、操作步骤（一）淀粉酶产生菌的分离1.培养基的配制及灭菌倒平板配制分离培养基高压灭菌30min冷却至约50℃倒7块平板/140mL冷却备用2.制备土壤稀释液①称取土样1g，放入9mL无菌水试管中，摇动10min，静置10min,制备得到10-1土壤稀释液；②用无菌吸管吸出1mL土壤悬液，加入盛有9mL无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到10-2土壤稀释液；③再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3土壤稀释液；④以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。3.涂布用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5、10-6和10-7土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。4.培养纯化挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养2～3d(如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养)。5.产淀粉酶微生物的鉴定向平板内加入稀碘液数滴后进行观察（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制1.淀粉酶产生菌的发酵①分离培养基（140mL）的配制：可溶性淀粉：0.7g蛋白胨：0.7g酵母膏：0.7gKH2PO4:0.07gMgSO4•7H2O:0.02gCaCl2•2H2O:0.08g琼脂:2.8g②配置发酵培养基200mL/组（40mL/瓶）将纯培养得到的（透明圈最大的）菌落接种于发酵培养基中30℃150r/min摇瓶发酵约72h。2.葡萄糖标准曲线的制作①精确称取0.100g葡萄糖，用缓冲溶液定容至100ml，制得浓度为1mg/ml的葡萄糖的标准溶液。标准曲线如下图表所示：葡萄糖标准溶液体积（ml）0.00.20.40.60.81.01.2葡萄糖含量（mg）0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS(ml)3333333定容总体积(ml)15151515151515OD（540nm）②待测酶液的制备：a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件4000转/5分钟，将离心后的上清液倾入试管中，稀释一定倍数测定其酶活力b.底物溶液—2%淀粉溶液（需当天配置）称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解；冷却，并用缓冲液定容至100mL。注：如果测定所得OD值不在有效值（0.2-0.8）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。③淀粉酶酶活测定方法操作步骤空白管样品管A样品管B步骤1吸取1.8mL可溶性底物溶液吸取1.8mL可溶性底物溶液吸取1.8mL可溶性底物溶液步骤237℃保温5分钟37℃保温5分钟37℃保温5分钟步骤3加入待测酶液0.2毫升加入待测酶液0.2毫升步骤437℃精确保温15min37℃精确保温15min37℃精确保温15min步骤5加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止反应步骤6混合均匀混合均匀混合均匀步骤7加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步骤8流水冷却流水冷却流水冷却步骤9加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀步骤10OD540nm比色OD540nm比色OD540nm比色五、酶活测定注意事项注：1.试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；2.移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！3.精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；4.避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；5.实验结果的记录与分析六、实验报告（一）淀粉酶产生菌的分离结果筛选结果稀释倍数产淀粉酶菌落数菌落形态透明圈大小10-36菌落疏松，呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状，大多为白色，有的为淡黄色和黑色1.1cm,1.0cm0.9cm,0.8cm0.5cm,3cm10-41绒毛状，圆形，白色0.8cm10-51絮状，白色0.9cm10-61絮状，淡黄色0.5cm10-70（二）葡萄糖标准曲线绘制①葡萄糖标准曲线的制作编号123456葡萄糖含量0.20.40.60.81.01.2OD（540nm）0.0840.2850.4910.7180.9221.133②糖化酶活力测定结果编号样品管A样品管BOD（540nm）0.3320.289③糖化酶活力的计算葡萄糖标准曲线y=0.9479x+0.126R2=0.999800.20.40.60.811.21.400.20.40.60.811.2OD葡萄糖含量（mg/ml）系列1线性(系列1)OD的平均值=（A+B）/2=(0.332+0.289)/2=0.3105根据酶活计算公式：酶活（U/g）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5A:样品的OD值(平均值)K:标准曲线的斜率N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000μmolW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）代入数据可得：酶活（U/g）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5=((0.3105×0.9479+0.126）×1×1000/(15×180.2))×5=0.77753、思考题：请你建立一个“筛子”，从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物。答：采集土样(除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm~10cm土壤)将采集的土样进行10-1~10-6梯度稀释后，分别涂布于改良的含溴甲酚绿的植酸钙平板初筛培养基上，在30℃的恒温箱中培养3d，然后观察菌落周围是否形成透明水解圈。因为培养集中含有水溶性较差的植酸钙，因而含植酸钙的平板上会呈现浑浊态。若菌株代谢产生植酸酶，植酸钙被酶降解，在菌落周围形成透明水解圈，可起到一定指示作用。此外可选取溴甲酚绿、溴甲酚紫、中性红及刚果红等4种常用染色剂添加至平板初筛培养基中，在加深培养基背景色的同时，以增强植酸钙水解后形成的透明圈可见性。