脐带间充质干细胞培养方法

(一)1.Sectionsof8–10cmofumbilicalcords,whichareroutinelydiscarded,wereinternallywashedwithphosphate-bufferedsaline(PBS),supplementedwith3%penicillin/streptomycin(Invitrogen-Gibco,GrandIsland,NY,)andimmediatelyimmersedinDulbecco’smodifiedEagle’smedium-lowglucose(DMEM-LG;Invitrogen-Gibco)supplementedwith10%fetalbovineserum(FBS;Invitrogen-Gibco)and3%penicillin/streptomycin(Invitrogen-Gibco).Allsampleswereprocessedwithin12–15haftercollection.2.UCswerefilledwith0.1%collagenase(Sigma-Aldrich,St.Louis,)inPBSandincubatedat37°Cfor20min.EachUCwaswashedwithproliferationmedium,andthedetachedcellswereharvestedaftergentlemassageoftheUC.Cellswerecentrifugedat300gfor10min,resus-pendedinproliferationmedium,andseededin25-cm^2flasksatadensityof5×10^7cellsperml.After24hofincubation,non-adherentcellswereremoved,andculturemediumwasreplacedevery3days.（二）HuMSCswerepreparedaspreviouslydescribed.8Wharton'sjellywasprocessedwithin24hoursofcollectionandcutintopiecesofabout1mm3forculture.Thesepieceswereplacedin24-wellplatesandculturedinDMEMsupplementedwith10%fetalbovineserum(FBS),5ng/mlEGF,5ng/mlbasicfibroblastgrowthfactor,100U/mlpenicillinand100mg/mlstreptomycin,and1μg/mlamphoterinB.Thecultureplatewasplacedinanincubatorwithsaturatedhumidityatabout37°Ccontaining5%(v/v)CO2.Themediumwaschangedeverythreedaysandthecellswerepassagedwhentheyreaching70%confluence.Adherentcellswererecoveredbytreatmentwith0.25%trypsinfor3to5minutesthencentrifuged.(三)脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块后放入200mL蓝盖试剂瓶，加入质量/体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30mL，置于恒温振荡仪内持续消化6h，100目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6孔板内，于37℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24h后换液。脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6孔板中进行3种培养体系的生长对比实验。第1个6孔板中细胞密度为1×10^7L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRORS™Medium和STEMPRO®MSCSFM3种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1∶1混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1∶2，1∶4，1∶16和100%替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔1为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3为MesenPRORS™Medium，孔4为STEMPRO®MSCSFM。第2个6孔板中细胞密度为2×10^7L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。(四)脐带间充质干细胞的体外分离培养(1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4C保存；(2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块；(3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化6h，100目筛网过滤收集细胞；(4)生理盐水冲洗细胞3次，每次2000rpm，8min；(5)用含10％FBS的DMEM／F12培养液重悬细胞，调整细胞密度为1x106cells／ml，接种于T．25培养瓶中，置于37。C、饱和湿度、5％C02培养箱内培养；(6)3天后全量换为MesenPRORSrMMedium培养液，弃去未贴壁的细胞与杂质，以后根据细胞生长情况，每3天换液一次。2．2．2脐带间充质干细胞的体外扩增(1)上述培养方法获得的细胞长到80％融合时，用0．25％胰蛋白酶和0．02％EDTA混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间，待胞质回缩，加含10％FBS的DMEM／F12培养液终止消化；(2)将细胞悬液1000rpm离心3min，原代细胞以1：1的比例进行传代，记为P1代；(3)传代第二天培养液换为MesenPRORSa-MMedium培养液。P2代以后按1：3或l：4的比例传代。直至细胞彼此融合，铺满瓶底再重复上述操作。（五）1．hUCMSCs的分离、传代：无菌条件下，将脐带剪成长约1．0cm的小段，充分洗涤残留于脐带血管内的血液和血凝块，去除脐静脉、脐动脉，将脐带小段剪碎至直径0．5cm大小的组织块，置于直径10．0cm培养皿中，以无菌镊将组织块按间距0．5cm摆放成整齐，以Wharton胶直接与皿底贴壁，加入少量含10％FBS和5％青链双抗的低糖DMEM培养液，保持瓶底湿润，但要避免组织块漂起，置于37oC、5％CO：饱和湿度的培养箱内培养，4h后添加5rIll培养液。3d后更换培养液，弃去漂浮游离组织块，2～3d换液1次，至细胞完全融合，结束原代培养。以无菌镊夹去贴壁的组织块，接近融合的hUCMSCs用0．25％的胰酶37℃消化3min，1200r／min离心3min，收集沉淀按1：3比例传代，进行扩增培养。体外培养细胞至第4代，接近90％融合时，以含0．25％胰蛋白酶消化液消化收集细胞，取约1×10^6个细胞悬于100txlPBS中，分别加入适量异硫氰酸标记CD29、CD31、CD44、CD45、CDl05抗体避光染色30min。CD34检测采用间接荧光标记法，细胞与CD34抗体反应30rain后，需再与异硫氰酸标记二抗避光反应30min。(六)1细胞的分离和培养经家属同意取足月健康产妇的新生儿脐带用于本研究，排除产妇有先兆子痫、感染性疾病及死胎者。胎盘娩出后立即结扎脐带，无菌处理后将脐带置于盛有D．Hank’S液(含有青链霉素)的无菌容器中，立即运送至实验室生物安全柜中存放。脐带采集后l小时内进行处理。在含D—Hank’S液的无菌容器中，用无菌手术刀切除脐带双侧带有夹痕和淤血的部分，用含有双抗的D．Hank’S液充分冲洗脐带的外周及脐动、静脉管腔。沿脐带纵轴切开，钝性分离脐带血管周围组织，暴露脐动、静脉，带齿镊轻柔地将脐动、静脉剔除。D—Hank’S液充分冲洗剩余的脐带组织后，将其置于另一个含D．Hank’S液的无菌容器中，带齿镊将其撕成约lmm^3大小的组织块。将组织块接种于预先用lmlDMEM。LG／F12培养基(含15％胎牛血清、10nmol／L地塞米松、100U／m1青霉素、1001ag／ml链霉素及100×ITS)润湿的T-25培养瓶底壁，均匀铺放，组织块间距约5mm，置于37℃、5％C02、饱和湿度的培养箱中，不干扰地放置72小时后换液。以后每周换液2～3次。倒置相差显微镜下观察贴块周围贴壁细胞爬出情况。注意换液操作动作轻柔，以免贴块漂浮。2～3周后去组织贴块。2细胞的传代当细胞贴壁生长至80％～90％汇合后，吸出培养液，用D—Hank’S液冲洗2次，加入胰蛋白酶／EDTA混合液进行消化。先将培养瓶置于37℃、5％C02、饱和湿度的细胞培养箱中孵育2分钟，之后取出并轻轻叩击培养瓶侧壁以加速消化。显微镜下观察分离出的细胞，待细胞浮起并由梭形变为圆形后，立即加入胎牛血清中止消化，收集所得细胞悬液，室温下以1000转／分离心8分钟。弃上清，用DMEM．LG／F12培养基重悬细胞，按1：2～l：