菌种质粒检查标准操作规程

细胞因子菌种质粒检查标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。目的：鉴定PBV888/DH5α菌种质粒酶切图谱的稳定性。原理：用碱裂解法提取质粒，用适当的限制性核酸内切酶消化，进行琼脂糖凝胶电泳，并与分子量标准品作比较，以验证消化后片段的大小。内容：1材料1．1菌种PBV888/DH5α，来源于主种子批或工作种子批。1．2注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。1．3λDNA/HindⅢ分子量标准品来源：Promega公司1．4试剂葡萄糖C6H12O6分析纯三羟甲基氨基甲烷（Tris）C4H11NO3分析纯浓盐酸HCl分析纯乙二胺四乙酸二钠C10H14N2O8Na2分析纯十二烷基磺酸钠（SDS）C12H25O4SNa分析纯乙酸钾C2H3KO2分析纯冰乙酸CH3COOH分析纯溴酚蓝C19H10O5Br4S分析纯二甲基苯青蓝C25H27N2NaO7S2分析纯蔗糖C12H22O11分析纯苯酚C6H5OH分析纯氯仿CHCl3分析纯乙酸钠CH3COONa分析纯无水乙醇CH3CH2OH分析纯溴化乙锭（EB）C21H20BrN3分析纯琼脂糖分析纯氢氧化钠NaOH分析纯1．5器皿Eppendorf管(1.5ml、500ml)、量筒（100ml、500ml、1000ml）、吸管（10ml）、烧杯（100ml、500ml、1000ml）、棕色试剂瓶、（500ml）、盐水瓶（500ml，250ml）1．6仪器设备电子天平ACS太原PH计PHS-3C上海大中分析仪器厂稳压稳流电泳仪LKB水平式凝胶电泳槽LKB台式离心机LDZ4-0.8A北京离心机厂水浴箱LKB移液器SocoREXSwiss针头式膜滤器GelmanScience紫外检测仪LKB生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂扭力天平TN-100B上海第二天平厂电子秤ES-200A型沈阳龙腾电子仪器公司微波炉1．7其它材料：牛皮纸、硫酸纸、片带、线绳、吸球（1ml、10ml）、剪刀、煤气灯、滤膜（0.2μm）。2方法2．1准备工作2．1．1生产环境：在十万级洁净室中进行。摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。2．1．2玻璃器皿的准备：经本室洗刷组处理烤干后，经121.3℃，60分钟高压蒸气灭菌后，待用。2．1．3针头式膜滤器，经本室洗刷组处理烤干后，装入一层0.2μm滤膜，用蒸馏水检验滤膜，确保通透正常后，用硫酸纸包好，121.3℃，60分钟高压灭菌后，待用。2．1．4调试仪器设备2．1．4．1确认电子秤运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2．1．4．2确认离心机运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2．1．4．3确认稳压稳流电泳仪运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2．1．4．4确认PH计运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2．1．4．5确认生物安全台运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2．1．4．6确认微波炉运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2．1．4．7确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。2．1．5溶液的配制2．1．5．110NNaOH，100ml：摘下电子秤“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，打开开关，放硫酸纸，校零。用电子秤称取NaOH40克，倒入100ml烧杯中，加80ml注射用水溶解，定容至100ml。倒入250ml盐水瓶中，标明浓度、名称、体积、批号、日期、室温待用。2．1．5．2100mM葡萄糖100ml摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机开关，吹30分钟，待用。摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，调零。用扭力天平称取葡萄糖1.8克溶于100ml注射用水，用玻璃棒搅拌使之溶解。在生物安全台中用0.2μm的针头式膜滤器过滤除菌，装入250ml盐水瓶，标明浓度、名称、体积、批号、日期，室温备用。2．1．5．310%SDS溶液100ml用扭力天平称取SDS10克，溶于100ml注射用水溶解后，装入250ml盐水瓶，标明浓度、名称、体积、批号、日期，室温备用。2．1．5．40.5MEDTAPH8.0，100ml摘下PH计“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源。用电子秤称取乙二胺四乙酸二钠18.61克，倒入烧杯中，加入80ml注射用水，搅拌，用NaOH调PH至8.0，然后定容至100ml，放入试剂瓶中，用硫酸纸，牛皮纸包口，用线绳系紧，标明浓度、名称、体积、批号、日期，121.3℃，60分钟高压灭菌，备用。2．1．5．51MTrisHClpH8.0100ml用电子秤称取Tris12.11克，倒入100ml烧杯中，加80ml注射用水搅拌溶解，加入浓盐酸4.2ml，待溶液冷却至室温后调PH至8.0，加水定溶至100ml，标明浓度、名称、体积、批号、日期。121.3℃60分钟高压灭菌，备用。2．1．5．6溴化乙锭（EB）100ml用扭力天平称取溴化乙锭1克，溶于100ml注射用水，搅拌使其完全溶解，移至棕色试剂瓶中，标明浓度、名称、体积、批号、日期、室温待用。2．1．5．7溶液I100ml取100mM葡萄糖50ml，1MTrisHCl（PH8.0）5ml，0.5MEDTA（PH8.0）2ml，加入灭菌注射用水定容至100ml，贴上标签，标明名称、体积、批号、日期，备用。2．1．5．8溶液II100ml（现用现配）取10NNaOH2ml，10%SDS10ml，加注射用水定容至100ml，贴上标签，标明名称、体积、批号、日期，备用。2．1．5．95M乙酸钾100ml用电子秤称取乙酸钾49克，溶于注射用水80ml中，搅拌使其完全溶解，定容至100ml，标明浓度、名称、体积、批号、日期。室温备用。2．1．5．10溶液III100ml量取5M乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，注射用水28.5ml，注入250ml试剂瓶中，混匀后标明浓度、名称、体积、批号、日期。室温备用。2．1．5．116X载样缓冲液100ml摘下电子天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，校零。用电子天平称取溴酚蓝0.25克、二甲基苯青蓝0.25克、蔗糖40克溶于80ml注射用水中，定容至100ml，混匀后装入试剂瓶中，标明浓度、名称、体积、批号、日期。室温备用。2．1．5．12TAE电泳缓冲液（50X贮存液）1000ml用电子秤称取Tris242克，乙二胺四乙酸二钠37.2克，倒入1000ml烧杯中，加入冰醋酸57.1ml，加注射用水定容至1000ml，摇溶，混匀，标明浓度、名称、体积、批号、日期。室温备用。2．1．5．13TE缓冲液（10mMPH8.0）1000ml取1MTrisHCl10ml、0.5MEDTA2ml加注射用水988ml，混匀后装于试剂瓶中，标明浓度、名称、体积、批号、日期。室温备用。2．1．5．1470%乙醇溶液100ml取无水乙醇70ml，用注射用水定容至100ml，混匀，装入250ml试剂瓶中，贴标签，标明液体名称、浓度、体积、批号、日期。室温备用。2．2操作步骤2．2．1质粒提取2．2．1．1摘下台式离心机“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源。将1.5ml发酵用菌种加入微量离心管中，用台式离心机4000rpm离心30秒。2．2．1．2吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。2．2．1．3将细菌沉淀重悬于用冰预冷的溶液I100μl，剧烈振荡成均匀悬液。2．2．1．4加入新配制的溶液II200μl，混匀，冰上放置5分钟。2．2．1．5加入用冰预冷的溶液Ⅲ150μl，混匀，冰上放置5分钟。2．2．1．6用微量离心机于4℃以12000rpm离心5分钟，将上清转移至另一离心管中。2．2．1．7加入等量酚、氯仿（1：1），振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000rpm离心2分钟，将水相转移至另一离心管中。2．2．1．8加入二倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温放置30分钟，沉淀质粒DNA。2．2．1．9用微量离心机4℃以12000rpm离心5分钟。2．2．1．10小心吸去上清，将离心管倒置于一张吸水纸上，以使所有液体流出，再将附于管壁上的液滴除尽。2．2．1．11用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA，按4.2.1.10方法去掉上清，在空气中使核酸干燥10分钟。2．2．1．12向微量离心管中加入100μlTE回溶质粒。2．2．2限制性核酸内酶消化：取质粒DNA10μl，加10倍缓冲液3μl（EcoRI自带），加入EcoRI1μl和PSTI1μl，补加注射用水至30μl，37℃水浴作用4小时。酶切反应体系：质粒DNA10μl10×buffer（EcoRI自带）3μlEcoRI1μlPSTI1μl注射用水15μl总体积30μl2．2．3琼脂糖凝胶的制备及电泳2．2．3．1稳压稳流电泳仪、水平式凝胶电泳槽、微波炉分别摘下“备用”标志牌，挂“运行”标志牌。用电子天平称取0.2g琼脂糖，加入1×TAE20ml，在微波炉中融化，混匀，冷却至55℃左右时，加入1μlEB，混匀，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。2．2．3．2待胶凝固后，从凝胶平台上除去封带，拨去梳子，放入加有足够TAE电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm。2．2．3．3取5-10μl质粒DNA和1-2μl6×载样缓冲液，混匀，然后用微量移液器加入样品孔中，同时用合适的DNA分子量标准品作对照。2．2．3．4接通电极，使DNA向阳极移动，在1-10v/cm凝胶的电压降下进行电泳。2．2．3．5当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。2．2．3．6紫外检测仪摘下“待处理”标志牌，挂上“运行”标志牌。接通电源。在紫外检测仪下观察，酶切片段的大小，大片段为3.65kb左右，小片段为500bp左右。经二人复核，填写工作记录。2．3工作结束后，场地摘下“使用中”标志牌，挂“待处理”标志牌。3结果判定3．1判定标准PBV888/DH5α菌种质粒酶切图谱与原始图谱相符合。3.2判定结果：判定结果经二人复核后，填写检定记录，注明菌种名称、批号、判定结果、判定日期、工作者及复核者等。4清场4．1配液清场4．1．1玻璃器皿用纯化用水冲洗后，送本室洗刷组处理。4．1．2称量后将各种药品放回原处，并做好称量及配液记录。4．1．3将电子秤、电子天平、扭力天平处理干净，放回原处并做好使用记录，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌。并填写使用纪录。4．1．4生物安全工作台用75%酒精棉擦净台内，继续吹风10分钟后，关风机开关，切断电源，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌。填写使用记录。4．1．5用专用抹布擦拭台面。4．2质粒提取及酶切清场4．2．1将操作过程中产生的废液倒入加有消毒液的废液罐中。4．2．2离心机、水浴箱等设备清理干净后，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌，填写设备使用记录。4．2．3用专用抹布擦拭台面，用专用拖布拖地。4．3电泳清场4．3．1电子天平、微波炉、电泳仪、紫外检测仪使用后清理干净，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌。并填写使用记录。4．3．2将电泳后的凝胶倒入垃圾桶中，并将凝胶平台及各种玻璃器皿，用纯化用水冲洗干净，玻璃器皿送洗刷。4．3．3将操作台面擦干净。4．4清场结束后由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下“待处理”标志牌，挂“清场合格”标志牌，并填写清场纪录。5注意事项5．1溴化乙锭是一种诱变剂，操作时要戴手套，必须小心操作。5．2SDS粉末极易扬起，对呼吸道有害，操作时要戴口罩，必须小心操作。5．3所有工作均应二人复核，并及时填写记录。