植物代谢组学

植物代谢组学及其应用河南农业大学生命科学学院赵会杰目录一、植物代谢组学的概念和意义二、代谢组学在系统生物学中的地位三、植物代谢组学的研究方法四、代谢组学在植物科学中的应用五、展望一、植物代谢组学的概念和意义1、概念生物学中“组”的概念：◆“组”：来源于希腊语ome，意指每个、所有、全部。◆以它为后缀最先用于基因组：genome,指一个物种的全部遗传组成。◆自基因组学概念提出后，带组学（omics)的概念出现有200多种。如蛋白组学、代谢组学等。近年来,随着生命科学研究的发展,尤其是完成拟南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻（Oryzasativa)等植物的基因组测序后,植物科学发生了翻天覆地的变化。有人说生命科学研究跨入了后基因组时代。人们已经把目光从基因的测序转移到了基因的功能研究。在研究DNA的基因组学、mRNA的转录组学和蛋白质的蛋白组学后,接踵而来的是研究代谢物的代谢组学。代谢组：是指细胞或者生物体内的所有代谢物的总和，也有人将它定义为细胞、组织、器官或者生物体内的所有小分子代谢组分的集合。代谢组学：通过大量代谢成分的定性、定量分析来定义生物体的生化表型(代谢表型)及其与基因型的关系，从而为研究基因功能、诠释生命现象提供大量的代谢信息，这就是代谢组学（metabolomics)。2、意义●通过研究不同物种的代谢产物,可以指导植物分类学,对植物进行更加合理的分类;●通过研究不同基因型植物的代谢物,可以发现新的功能基因,促进转基因植物的研究,同时还可以对转基因植物及其在食用方面的安全性进行代谢物组学水平上的评估;●通过研究不同生态环境下植物的代谢产物,了解植物的区域性分布。如果所研究的植物是某种药用植物,则就可以应用于中药道地药材的确定;●植物在受到某种内部或外界因素刺激之后会产生的特定的应激变化,最终会表现在代谢物的改变上,通过研究这种变化规律,为从植物中定向培养得到某一特定代谢物提供指导。20世纪末到本世纪初，大规模的基因组测序工作产生了海量数据。但仅仅是依赖DNA序列我们能够得到的信息还是有限的，科学家迫切希望在整体水平上了解基因表达的特征和基因所编码的产物的功能。因此，“功能基因组学(functionalgenomics)”的研究逐渐兴起。它是通过大规模地分析细胞内转录水平(转录组)和蛋白质水平(蛋白质组)上的变化，进而推测基因功能，这就开启了“功能基因组学”的研究。二、代谢组学在系统生物学中的地位然而，转录组和蛋白质组不一定能很好地预测基因的功能。尽管转录组携带了细胞内蛋白质合成的密码子，但是mRNA水平上的增加与蛋白质水平的增加并不一致，况且蛋白质合成后的各种修饰往往带来活性的改变。考虑到这些因素，仅凭转录组或者蛋白质组的改变不一定能够准确预测生化表型(代谢物)的改变。另外，在建立转录谱和蛋白谱的时候，要鉴定一种mRNA或者蛋白质，现代的技术手段主要是通过序列相似性比对和与数据库的匹配来确定的，这样的鉴定主要依赖于匹配度，因此不是直接的。由于现有数据库信息的缺乏，转录组和蛋白质组也就只能提供有限的信息。代谢组可以在代谢物的基础上来区分表型；不论是可见的还是不可见的表型，用代谢物来区分可能是更无偏见的，至少是提供了代谢水平上的证据。而且，在那些由突变体或者转基因造成的可以测量的表型变化的实例中，代谢组的方法可以被用来阐明造成这种可见表型的生化原因或者结果。因此，以DNA、mRNA、蛋白质和代谢物为研究对象的基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学是一个密切相关的整体，他们共同构成系统生物学（systemsbiology)。基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的关系系统生物学研究的四个层次代谢组学研究技术步骤三、植物代谢组学的研究方法植物材料培养数据分析与解释样品制备成分分析与鉴定1、植物培养（栽培）对研究对象进行培育的目的是为了对样本的稳定性进行控制,相对于微生物和动物而言,植物的人工栽培需要考虑更多的问题,如中药材在不同年龄、不同发育阶段、不同部位以及光照、水肥、耕作等环境因素的微小差异都可引起生理状态的变化,而这些非可控及可控双重因素的影响很难进行精确的控制,从而影响药用植物代谢组研究的重复性。为了解决以上问题,推荐使用大容量的培养箱,定时更换培养箱中栽培对象的位置,以及使用无土栽培技术等,利用无土栽培系统将水和养分直接引入植物根部,并且对供给量进行精确地控制,大大提高了实验的重复性。植物代谢物样品制备分为组织取样→匀浆→抽提→保存→样品预处理等步骤。代谢产物通常用水或有机溶剂(如甲醇和己烷等)分别提取,获得水提取物和有机溶剂提取物,从而把非极性的亲脂相和极性相分开。分析之前,通常先用固相微萃取、固相萃取和亲和色谱等方法进行预处理。然而植物代谢物千差万别,其中很多物质稍受干扰结构就会发生改变,且对其分析鉴定所采用的设备也不同。目前还没有适合所有代谢物的抽提方法,通常只能根据所要分析的代谢物特性及使用的鉴定手段选择合适的提取方法。而抽提时间、温度、溶剂成分和质量及实验者的技巧等诸多因素也将影响样品制备的水平。2、样品制备对获得的样品中所有代谢物进行分析鉴定是代谢组学研究的关键步骤,也是最困难和多变的步骤。与原有的各种组学技术只分析特定类型的物质不同,代谢组学分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学参数差异很大,要对它们进行无偏向的全面分析,单一的分离分析手段往往难以保证。色谱、质谱、核磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检测和光散射等分离分析手段及其组合都被应用于代谢组学的研究。一般根据样品的特性和实验目的,可选择最合适的分析方法。目前最常用的分离分析手段：◆气相色谱和质谱联用(GC/MS)◆液相色谱和质谱联用(LC/MS)◆毛细管电泳－质谱联用技术(CE/MS)◆核磁共振(NMR)◆傅里叶变换红外光谱与质谱联用(FTIR/MS)。3、成分分析鉴定(1)气相色谱和质谱联用(GC/MS)液相色谱和质谱联用(LC/MS)色谱是最常用和有效的分离分析工具,其与质谱的联用则可以完成从成分分离到鉴定的一整套工作。GC/MS和LC/MS可以同时检测出数百种化合物,包括糖类、有机酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代谢物。GC/MS有很好的分离效率且相对较为经济,但需要对样品进行衍生化预处理,这一步骤会耗费额外的时间,甚至引起样品的变化。受此限制,GC/MS无法分析膜脂等热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。Forexample:Roessner等(2000,2001)利用GC/MS对马铃薯进行高通量代谢物分析,同时检测到150种化合物,其中77种被鉴定为氨基酸、有机酸或糖。利用GC/MS进行代谢组学研究的代表性工作是Fiehn等(2000)的一系列有关植物代谢的研究。他们用GC/MS对模式植物拟南芥的叶子提取物进行了研究,定量分析了326个化合物,并确定了其中部分化合物的结构。LC/MS中目前应用较广的是高效液相色谱和质谱联用(HPLC/MS)。HPLC与GC原理相似,但在进样前不需进行衍生化处理,适合那些不稳定、不易衍生化、不易挥发和分子量较大的化合物。HPLC/MS选择性和灵敏度都较好,但分析的时间相对较长,且需依赖纯的参照物。Fiehn(2003)利用HPLC/MS检测笋瓜(CucurbitamaximaGelberZentner)叶柄和叶片抽提物,检测到了超过400种代谢物,有90种被定性,其中大部分是氨基酸、糖和糖苷。Huhman和Sumner(2002)在紫花苜蓿和蒺藜状苜蓿中各鉴定出15个和27个皂角甙,并在紫花苜蓿中找到了2个新的乙二酸皂角甙。（2）毛细管电泳－质谱联用技术(CE/MS)CE/MS分离样品效率比普通的色谱质谱联用要高得多,更为便利的是其耗时很短,往往在10分钟内就能完成一个样品的分析过程。Tolstikov等(2003)用CE/MS对拟南芥进行代谢组分析,分离效果远远超过了Fiehn等用GC/MS进行的先期工作,检测到超过700个不同的色谱峰值,其中包括许多以前未检测到的脂类化合物及次生代谢物。（3）核磁共振在代谢组学领域,核磁共振最初被用于病理生理学和药理毒理学方面，但目前也已被广泛用于植物代谢组学研究。其优点是：A.不同于质谱具有离子化程度和基质干扰等问题,NMR没有偏向性,对所有化合物的灵敏度是一样的。B.NMR无损伤性,不破坏样品的结构和性质,可在接近生理条件下进行实验,可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件,可以进行实时和动态的检测。C.NMR氢谱的谱峰与样品中各化合物的氢原子是一一对应的,所测样品中的每一个氢原子在图谱中都有其相关的谱峰,图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量,更为直观。因此,NMR方法很适合研究代谢产物中的复杂成分。Examples:Ward等(2003)用1H-NMR对多种不同生态型的拟南芥进行了代谢组分析,在碳水化合物和脂肪族物质中都发现了差异,说明了植物代谢物和生态型差异的相关性。Hyung-Kyoon等(2004)用1H-NMR对野生型和过表达水杨酸合成基因的转基因烟草(Nicotianatabacum)的叶片和叶脉进行了研究,通过进行TMV嫁接和对照实验,得到多个峰值变化,大部分峰被鉴定为氯原酸、苹果酸和糖。此实验提供了一种有效的不需过多步预处理程序的区分野生型和转基因植物的方法。NMR也有其缺点:①与GC/MS和LC/MS相比,NMR的缺点是灵敏度低,有可能形成信号重叠,且其对样品制备的要求很高。②因为动态范围有限,很难同时测定生物体系中共存的浓度相差较大的代谢产物。（4）傅里叶变换红外光谱-质谱联用FTIR/MSFTIR主要测定样品中各成分的功能基团和高极性键的振动,而特定的化学结构有特定的吸收频率,通过测定实验样品的红外吸收频率和强度,可以辨别出各个成分。FTIR优点：扫描速度快、光通量大、高分辨率、高信噪比及测定光谱范围宽。FTIR缺点：不可区分异构物,且组分片段和一些络合离子也对其有影响,由于离子抑制不能进行定量分析。Examples：Aharoni等(2002)利用高分辨率的FTIR/MS联用仪器对凤梨草莓(Fragariaananassa)组织进行了分析,依据不同的质荷比找到了5844个不同质量的物质,并根据对化合物中高含量的元素的精确质量测定估计了其中一半以上物质的化学结构式。结果表明,在草莓的不同组织中都含有多种类的初生代谢物(如氨基酸、脂肪酸和碳水化合物)及次生代谢物(如类黄酮和萜类化合物)。4、数据分析与解释样品成分分析鉴定之后,需要对所获得的数据进行相应的整合处理,这也是代谢组学研究中十分关键的步骤。应用高通量的检测分析工具可以得到海量的数据,如果不对其进行合理的处理,这些纷扰的数据反而对研究工作是有害无利的。可应用模式识别和多维统计分析等方法从这些大量的数据中获得有用的信息,这些方法能够为数据降维,使它们更易于可视化和分类。目前数据分析常用的方法有两类：●非监督方法(unsupervisedmethod)●有监督方法(supervisedmethod)（1）非监督（学习）方法非监督方法是用来探索完全未知的数据特征的方法,对原始数据信息依据样本特性进行归类,把具有相似特征的目标数据归在同源的类里,并采用相应的可视化技术直观地表达出来。应用在此领域的常见方法有:●聚类分析(clusteranalysis)●主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)聚类分析：依据物以类聚的原理分析具有相似性的事物,将分类对象置于一个多维空间中,根据事物彼此不同的属性进行辨认,将性质相近的归入一类,这样归在同一类的事物具有高度的相似性;聚类分析就是把事物按其相似程度进行分类,并找出每一类事物共同特征的分析工具。具体到代谢组学中,被归入一类的物质有相同的特征,可能有相同的功能作用,这样通过同一类事物中一个研究较为清晰的物质可以推断该类中其他物质的功能作用。聚类分析过程通常可分为以下步骤:数据收集并且收集相应的变量→产生一个相似