中华猕猴桃矮型性状EST-SSR连锁标记的筛选

园艺学报，（）：–2010374553558ActaHorticulturaeSinica收稿日期：2009–11–04；修回日期：2010–03–16基金项目：国家自然科学基金项目(30660113，30860167)中华猕猴桃矮型性状EST-SSR连锁标记的筛选徐小彪*，姜春芽，廖娇，辜青青，刘善军，陈金印（江西农业大学农学院，南昌330045）摘要：以中华猕猴桃（ActinidiachinensisPlanch）矮型种质‘赣猕5号’为母本，普通型中华猕猴桃‘奉雄2号’为父本构建F1群体，采用优越而高效的基于表达序列标签（ExpressedSequenceTags，EST）的简单序列重复（SimpleSequenceRepeats，SSR）标记技术，结合群体分离分析法（BulkedSegregantAnalysis，BSA）在荧光DNA测序仪（ABI3130）上进行了‘赣猕5号’矮型性状连锁的EST-SSR分子标记研究。结果表明，通过本实验室开发并设计的85对EST-SSR荧光引物的扩增筛选，其中引物EST-Ad042在亲本及其矮型与普通型DNA池之间扩增出一条285bp的多态性片段，经对其F1代分离群体部分矮型与普通型单株的随机验证，该片段稳定出现，在矮型植株中表现为有带，在普通型植株中表现为无带。遗传连锁分析表明，该标记与矮型基因之间的连锁距离为8.8cM。EST-SSR荧光引物能够有效地筛选到中华猕猴桃的特异标记，可以作为鉴别矮型与普通型植株的标记引物。关键词：猕猴桃；矮型性状；EST序列；SSR标记中图分类号：S663.4文献标识码：A文章编号：0513-353X（2010）04-0553-06ScreeningofEST-SSRMarkerLinkedtoDwarfCharacterinActinidiachinensisPlanchXUXiao-biao*，JIANGChun-ya，LIAOJiao，GUQing-qing，LIUShan-jun，andCHENJin-yin（CollegeofAgronomy，JiangxiAgriculturalUniversity，Nanchang330045，China）Abstract:Higheffectivesimplesequencerepeats（SSR）markerbasedonexpressedsequencetags（EST）andthemethodofbulkedsegregantanalysis（BSA）ontheautomatedfluorescent-labeledsystem（ABI3130）wereemployedtoscreenthemolecularmarkerlinkedtodwarfgeneinkiwifruit（Actinidiaspp.）fromtheF1separatingprogeniesobtainedfromthecrossbetweendwarfcultivar‘Ganmi5’（♀）andnormalcultivar‘Fengxiong2’（♂）ofActinidiachinensisPlanch.Eighty-fivepairsoffluorescentprimersweredesignedandscreenedinthepresentstudy.Theresultsshowedthatapolymorphicbandof285bpamplifiedbyprimerEST-Ad042wasoccuredbothinthedwarfparentandinthedwarfcultivarsofseparatingDNApoolsbutnotinnormalcultivar.Furthermore，thepolymorphicbandhadbeenapprovedbystochasticamplificationintheF1separatingprogeniesincludingdwarfandnormalgenotypes，respectively.ThegeneticdistancebetweentheEST-SSRmarkeranddwarfgenecouldbe8.8cMbygeneticlinkageanalysis.ThespecificmolecularmarkerofkiwifruitcouldbeeffectivelyminedbyfluorescentEST-SSRprimers，andthefluorescentprimerEST-Ad042couldbeutilizedto﹡E-mail:[e-mail]554园艺学报37卷identifyitsdwarfplant.ThescreeningofmolecularmarkerslinkedtodwarfgeneinActinidiachinensisPlanchhadbeenprovidedabasisforthestudiesofdwarfgenemappingandcloninginkiwifruitbreedingprogram.Keywords：Actinidia；kiwifruit；dwarfcharacter；ESTsequence；SSRmarker猕猴桃搭架栽培是影响其生产效益的主要制约因素。因此，矮型性状是猕猴桃育种者和生产者关注的重要性状。‘赣猕5号’是中华猕猴桃（ActinidiachinensisPlanch）自然实生的矮化突变体，株形紧凑，节间枝条短缩，冠幅小，矮型性状稳定，是矮化无架密植栽培的优良种质，也是猕猴桃矮型育种及观赏育种的良好亲本材料（毕诗忠等，2001）。近年来，国内外学者在果树矮化性状方面开展了一些研究，利用不同的分子标记手段也标记定位了一些矮化相关的基因。毕晓颖等（2002）获得了1个与苹果显性矮化主基因Dw连锁距离为0.69cM的RAPD标记。Tian等（2005）已用RAPD、SSR及SCAR标记对苹果的Co基因进行了标记及区域作图。贾彦利等（2007）获得了一个与控制梨树矮化性状基因pcDw连锁距离为8.3cM、长度为940bp的RAPD标记S1172-940，并将其转换成了SCAR标记，即SCAR-940。田义轲等（2008）对来自西洋梨的矮化型突变基因pcDw进行了SSR分子标记研究，获得了一个与pcDw基因连锁距离为9.3cM的SSR标记KA14210，并将该基因定位到了梨品种Barlett遗传图谱的第16连锁群上。目前，新型的EST-SSR标记已成为重要农艺性状定位、基因作图、遗传多样性、比较基因组学研究的新型重要工具（Varshneyetal.，2005）。据此，本研究中采用高效的基于EST的SSR标记技术，利用BSA法对中华猕猴桃矮型种质‘赣猕5号’的矮型性状进行鉴定与分析，旨在筛选出与中华猕猴桃矮型性状连锁的EST-SSR标记，以便为该矮型基因的定位与克隆奠定基础。1材料与方法试验材料为矮型中华猕猴桃‘赣猕5号’（母本，F；2n=2x=58）、普通型中华猕猴桃‘奉雄2号’（父本，M；2n=2x=58）及其F1代。2007年9月采集F1代种子。2008年2月播种，共获得F1代幼苗171株。2008年11月，F1幼苗植株生长基本停滞，此时进行F1代单株的矮型性鉴定。以普通一年生实生苗的平均高度为对照，苗高低于其1/2的划分为矮化型。根据F1代不同单株矮化型和普通型的分离比例，用卡方检验确定矮型基因的遗传方式。分别随机获取F1代普通型分离个体（N）46株（编号为PT1~PT46）和矮型分离个体（D）46株（编号为AH47~AH92）作为矮型性状特异EST-SSR标记的验证材料。采集新鲜嫩叶提取基因组DNA，采用CTAB法（Murry&Thompson，1980）加以改进（徐小彪等，2004）在0.8％琼脂糖凝胶上电泳检测DNA质量，将DNA模板浓度调至10ng·μL-1，−20℃保存备用。PCR反应体系为15μL，内含模板DNA20ng，10×buffer1.5μL，25mmol·L-1的MgCl21.2μL，dNTPs0.2μL，上游引物0.15μL，下游引物0.3μL，M13（序列GTTTTCCCAGTCACGACGTTG）用量为0.3μL，TaqDNA聚合酶0.2U。PCR反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，经30个循环后，94℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸30s，12个循环，最后延伸20min，10℃保存，试剂为上海博彩公司产品。基因池按照聚丙烯酰胺电泳的基因池及方法。PCR产物的检测采用荧光标记引物检测，引物合成时采用荧光FAM标记5'端寡核苷酸。荧光标记产物在DNA测序仪（ABI3130）上电泳并收集数据。按照BSA（Michelmoreetal.，1991）分析方法构建两个表型的基因池，矮型基因池（DwarfBulk，D）由10株矮化个体的等量DNA混合而成，普通型基因池（NormalBulk，N）由10株普通4期徐小彪等：中华猕猴桃矮型性状EST-SSR连锁标记的筛选555型个体的等量DNA混合而成。矮型母本（F）、普通型父本（M）及两个基因池用于筛选与矮型性状连锁的EST-SSR分子标记。用本实验室开发并设计的85对EST-SSR引物对两个基因池以及亲本进行多态性筛选，两个基因池之间的多态条带如果在亲本间也同样存在，则表明该多态性片段（条带）可能与目标性状连锁。为进一步验证其连锁关系，用产生多态性的引物对F1代单株进行验证。采用MAPMAKER/EXE3.0软件对F1分离群体中矮型性状和EST-SSR分子标记的分离数据进行连锁分析，并计算遗传图距。2结果与分析2.1猕猴桃两个基因池和亲本间的多态性分析以矮型与普通型中华猕猴桃的近等基因池（Bulk）DNA为模板，利用本实验室开发设计的85对猕猴桃荧光引物（上海捷瑞合成）在自动荧光DNA测序系统（ABI3130）进行EST-SSR分析。EST-Ad042的引物序列为：F5'-GTTAATTTGATCGGGATGG-3'；R5'-GAGGAGCTTGAGCTGCTAT-3'（重复基元：CAC）。研究结果表明，引物EST-Ad042在矮型近等基因池中扩增出一条特异谱带，片段大小为285bp（图1，D），而在普通型近等基因池中未发现（图1，N）。进一步经过验证亲本的研究表明，EST-Ad042在携带矮型基因的母本（赣猕5号）也扩增出位置相同的特异性条带（图1，F），而父本（奉雄2号）不存在（图1，M）。图1引物EST-Ad042在对比基因池与亲本自动荧光测序系统中的扩增结果D.矮型基因池；N.普通型基因池；F.母本；M.父本。Fig.1AmplificationinbulksandparentsforprimerEST-Ad042ontheautomatedfluorescent-labeledsystemD.Dwarfbulk；N.Normalbulk；F.Femaleparents；M.Maleparents.2.2猕猴桃EST-SSR标记引物的F1代单株验证在杂种F1代群体中，分别随机获取矮型和普通型猕猴桃单株进行EST-SSR标记引物的验证，发现引物EST-Ad042在矮型单株AH53、AH54、AH58、AH59、AH88、AH89中均扩增出片段大小为285bp的一条特异谱带（图2），而普通型单株中未出现该特异条带（图3）。图3是引物EST-Ad042在杂种F1代普通型单株PT9、PT11、PT13、PT24、PT25、PT33自动荧光测序仪中的扩增图谱，结果表明在285bp处未出现特异谱带。由此认为，EST-Ad042为矮型单株的特异性EST-SSR标记，它与中华猕猴桃矮型性状紧密连锁，可将该引物作为鉴别矮型和普通型植株的标记引物。556园艺学报37卷图2引物EST-Ad042在部分矮型单株自动荧光测序仪中的扩增图