病毒的鸡胚培养

实验九实验九新城疫病毒的鸡胚培养新城疫病毒的鸡胚培养与病毒滴度检测与病毒滴度检测扬州大学兽医学院扬州大学兽医学院成大荣成大荣20092009年年55月月44日星期一日星期一一、目的要求一、目的要求1.1.掌握鸡胚接种的掌握鸡胚接种的常规常规方法；方法；2.2.学习学习NDVNDV的分离培养及其鉴定方法。的分离培养及其鉴定方法。二、背景知识介绍二、背景知识介绍1.1.病毒的鸡胚培养病毒的鸡胚培养①①鸡胚鸡胚是正在发育的活体是正在发育的活体：：••组织分化程度低组织分化程度低；；••细胞代谢旺盛细胞代谢旺盛；；••适于许多病毒的生长增殖适于许多病毒的生长增殖，，尤其是禽类病毒。尤其是禽类病毒。②②鸡胚培养的鸡胚培养的优点：优点：••来源充足；来源充足；••价格低廉；价格低廉；••操作简单，无需特殊设备；操作简单，无需特殊设备；••易感病毒谱较广；易感病毒谱较广；••对接种的病毒不产生抗体。对接种的病毒不产生抗体。③③鸡胚培养的鸡胚培养的缺点：缺点：••非非SPFSPF鸡胚，可能含有某些家禽鸡胚，可能含有某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、支原体、鸡有鸡白痢沙门氏菌、支原体、鸡白血病病毒、鸡贫血病毒等。白血病病毒、鸡贫血病毒等。④④鸡胚接种的方法：鸡胚接种的方法：••尿囊腔接种：尿囊腔接种：••绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种••卵黄囊接种卵黄囊接种••羊膜腔接种羊膜腔接种••静脉接种静脉接种④④鸡胚接种的方法：鸡胚接种的方法：••尿囊腔接种尿囊腔接种••绒毛尿囊膜接种：绒毛尿囊膜接种：••卵黄囊接种卵黄囊接种••羊膜腔接种羊膜腔接种••静脉接种静脉接种④④鸡胚接种的方法：鸡胚接种的方法：••尿囊腔接种尿囊腔接种••绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种••卵黄囊接种：卵黄囊接种：••羊膜腔接种羊膜腔接种••静脉接种静脉接种④④鸡胚接种的方法：鸡胚接种的方法：••尿囊腔接种尿囊腔接种••绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种••卵黄囊接种卵黄囊接种••羊膜腔接种：羊膜腔接种：••静脉接种静脉接种④④鸡胚接种的方法：鸡胚接种的方法：••尿囊腔接种尿囊腔接种••绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种••卵黄囊接种卵黄囊接种••羊膜腔接种羊膜腔接种••静脉接种静脉接种：：2.2.新城疫病毒新城疫病毒①①副粘病毒科副粘病毒科//副粘病毒亚科副粘病毒亚科//禽禽腮腺炎病毒属腮腺炎病毒属。。②②新城疫的病原体。新城疫的病原体。③③形态：形态：••病毒子多呈球形；病毒子多呈球形；••单股负股单股负股RNARNA；；••核衣壳螺旋形对称；核衣壳螺旋形对称；••有囊膜；有囊膜；••囊膜表面有纤突。囊膜表面有纤突。④④血凝性：可凝集人、鸡、豚鼠和小白鼠的红细胞。血凝性：可凝集人、鸡、豚鼠和小白鼠的红细胞。⑤⑤病毒分离培养：病毒分离培养：9~119~11日龄鸡胚尿囊腔接种。日龄鸡胚尿囊腔接种。1.1.常规接种工具：注射器、打孔器、酒精灯等；常规接种工具：注射器、打孔器、酒精灯等；2.2.待接种的新城疫病毒材料；待接种的新城疫病毒材料；3.3.9~119~11日龄鸡胚（日龄鸡胚（11个个//人）；人）；4.4.灭菌生理盐水；灭菌生理盐水；5.5.其他：其他：••镊子、照蛋器镊子、照蛋器；；••酒精棉球、碘酊棉球；酒精棉球、碘酊棉球；••固体石蜡；固体石蜡；••灭菌瓶子、灭菌吸管灭菌瓶子、灭菌吸管等。等。三、实验材料三、实验材料四、实验内容四、实验内容1.1.照胚：照胚：取取9~129~12日龄发育良好的鸡胚，观察气室及胚胎位置，日龄发育良好的鸡胚，观察气室及胚胎位置，标出气室底边，在无大血管处标出尿囊腔注射部位。标出气室底边，在无大血管处标出尿囊腔注射部位。以尿囊腔接种为例，介绍新城疫病毒的接种方法：以尿囊腔接种为例，介绍新城疫病毒的接种方法：2.2.消毒消毒••气室向上放置鸡胚于卵架上；气室向上放置鸡胚于卵架上；••先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋壳所标记的位置。先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋壳所标记的位置。3.3.打孔打孔••在所标记注射部位用剪刀尖端打孔；在所标记注射部位用剪刀尖端打孔；••注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。距气室底边距气室底边0.5cm0.5cm4.4.注入病毒材料注入病毒材料••用用1mL1mL注射器抽取接种物；注射器抽取接种物；••针头垂直刺入注射部位针头垂直刺入注射部位11--1.2cm1.2cm即达尿囊腔内；即达尿囊腔内；••注入待接种的新城疫病毒：接种量为注入待接种的新城疫病毒：接种量为0.1~0.2mL0.1~0.2mL。。5.5.封孔封孔••用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。6.6.孵育与观察孵育与观察••气室朝上于气室朝上于3737℃℃温箱中孵育；温箱中孵育；••以后每天检卵以后每天检卵1~21~2次。次。••弃去弃去24h24h内的死亡鸡胚：内的死亡鸡胚：––机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。7.7.病毒的收获与鸡胚的观察病毒的收获与鸡胚的观察①①收集收集24h24h后死亡鸡胚，置后死亡鸡胚，置44℃℃冰箱过夜，以免收获时流血冰箱过夜，以免收获时流血;;②②取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面；取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面；③③用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜；用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜；④④以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊液，置无菌容器中保存备用。尿囊液，置无菌容器中保存备用。一般能尿囊液一般能尿囊液66--10mL10mL。。⑤⑤取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。8.8.新城疫病毒滴度的检测新城疫病毒滴度的检测血凝试验（血凝试验（HAHA））••凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数,,称为该病毒的称为该病毒的血凝滴度。血凝滴度。六、思考题六、思考题1.1.鸡胚接种过程中，应该注意的问题？鸡胚接种过程中，应该注意的问题？2.2.接种病毒后，接种病毒后，24h24h内鸡胚死亡原因？内鸡胚死亡原因？3.3.如何判断新城疫病毒的血凝滴度？如何判断新城疫病毒的血凝滴度？4.4.临床上还有哪些病毒具有血凝性？临床上还有哪些病毒具有血凝性？