临床分子生物学检验--绪论

L/O/G/O临床分子生物学检验姜威Contents临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验内容及其应用存在的问题以及标准化123临床分子生物学发展方向41.临床分子生物学定义及其发展临床医学的主要任务是什么？研究疾病的病因、诊断、治疗和预后，提高临床治疗水平，促进人体健康临床检验的主要任务1.临床分子生物学定义及其发展临床检验临床微生物检验临床免疫检验临床生化检验临床分子生物学检验临床血液学检验1.临床分子生物学定义及其发展望问闻切1.临床分子生物学定义及其发展公元前300年，希波克拉底提倡尿液检查诊断疾病。1500年，内科医生开始使用尿液颜色比对图进行直观尿液分析。1590年，hasjanssen发明了复式显微镜。1592年，伽利略发明了温度计。1684年，安东·范·列文虎克出版了第一本细菌绘图。临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的定义？临床分子生物学检验（clinicalmolecularbiology）是利用分子生物学理论与技术从基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等水平研究疾病的发生发展机制、疾病的预测与风险评价、疾病的临床诊断与治疗，以及疾病的预防与控制.1.临床分子生物学定义及其发展第一代检验诊断早期细胞形态雪检验第二代检验诊断20世纪50年代生化检验第三代检验诊断20世界60年代免疫学检验第四代检验诊断基因（分子生物学）检验诊断以疾病表型改变为依据非特异滞后难以早期诊断以疾病基因为探测对象特异性强、敏感可以早期诊断临床检验的发展第四代检验诊断第三代检验诊断1.临床分子生物学定义及其发展1.临床分子生物学定义及其发展1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋模型，现代分子生物学开始兴起，为分子检验奠定了基础临床分子生物学检验的发展DNA双螺旋的发现JamesWatson和FrancisCrick1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展：DNA杂交技术1976年，美籍华裔科学家简悦威（YuetWaiKan）首次利用液相DNA分子杂交技术，进行了α地中海贫血的产前诊断简悦威，汉族，医学家。美国国籍。国际医学界知名的遗传学和“脱氧核糖核酸”（DNA）专家。第一阶段核心技术：分子杂交技术以基因突变位点(导致单基因疾病）为靶标1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:PCR技术的发明1985年，聚合酶链式反应（PCR）技术的创建，使大量获得靶DNA片段成为可能,大大提高检测的特异性和灵敏性穆利斯(K.B.Mullis)PCR技术的发明者1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:PCR技术的发明PCR仪琼脂糖凝胶电泳仪1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:PCR技术的发明荧光PCR仪凝胶成像系统临床分子生物学检验的发展:PCR技术的发明以PCR技术为基础，产生的衍生技术：PCR-限制性酶切片段长度多态性（PCR-RFLP）等位基因特异性PCRPCR-单链构象多态性技术（PCR-SSCP）实时定量荧光PCR(QuantitativeReal-timePCR)第二阶段核心技术：聚合酶链式反应（PCR）技术以基因组特异性序列（DNA,RNA）为靶标为获得性（病原微生物）基因疾病（DNA,RNA）的诊断提供了有效的方法。1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:PCR技术的发明1.临床分子生物学定义及其发展PCR电泳结果Q-PCR结果1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:以生物芯片为代表的高通量密集型技术最早的微阵列图片生物芯片：一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子（如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等）的微阵列杂交型芯片。1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:以生物芯片为代表的高通量密集型技术1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:以生物芯片为代表的高通量密集型技术基因芯片基因芯片热图第三阶段核心技术：生物芯片（biochip）高通量技术以基因组特异性核酸序列（DNA,RNA），蛋白质分子为靶标为复杂性（多因素，多基因）疾病提供了有效的分子生物学检验方法1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:DNA测序技术测序峰图sanger第四阶段核心技术：DNA测序技术（蛋白质质谱技术）以基因组特异性核酸序列，蛋白质分子，代谢物为靶标特点：高灵敏度，高特异性，高通量，高自动化1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:DNA测序技术核酸测序技术为临床疾病扥分子诊断提供最精确的判定依据，是分子生物学检验的金标准测序方法：第一代：双脱氧末端终止法第二代：焦磷酸测序法第三代：单分子实时测序，大大降低成本，有望实现1000USD对人类基因组进行测序1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:蛋白技术蛋白芯片技术1.临床分子生物学定义及其发展临床分子生物学检验的发展:蛋白技术检测到阳性胃癌蛋白指纹2.临床分子生物学检验内容及其应用临床分子生物学检验的靶标狭义的讲，目前分子生物学检验的靶标主要以核酸为主广义上讲，临床分子检验的生物标志物包含基因组DNA,各种RNA，蛋白质以及代谢物。2.临床分子生物学检验内容及其应用单基因病（孟德尔遗传性疾病）镰刀状红细胞贫血症的检测一种常染色体退化遗传病引起原因：珠蛋白的β基因发生了一个点突变β基因的第6位密码子为GAG,编码谷氨酸,突变后为GTG,编码缬氨酸。检测方法：该突变导致该基因丢失了一个可被MstII切开的限制性内切酶位点。单基因病（孟德尔遗传性疾病）2.临床分子生物学检验内容及其应用脆性X染色体综合征脆性X染色体综合征导致患者智障（Martin-Bell综合征），脆性X综合症是由于在人体内X染色体的形成过程中的突变所导致。已发现了致病基因FMR-1，它含有（CGG）n三核甘酸重复序列，后者在正常人约为30拷贝，而在正常男性传递者和女性携带者增多到150~500bp，称为小插入，相邻的Cpg岛未被甲基化，这种前突变（premutation）无或只有轻微症状。现已可用RFLP连锁分析、DNA杂交分析、PCR扩增等方法检测成年型多囊肾病单基因病（孟德尔遗传性疾病）2.临床分子生物学检验内容及其应用成年型多囊肾病是一种常染色体显性遗传病，发病率高，约1000人中有1名致病基因的携带者，起病较晚，多在30岁以后，主要为肾和肝中出现多发性囊肿由于通过家系分析，已证实APKD的致病基因与α珠蛋白基因3’端附近的一段小卫星DNA序列即3’HVR(3’hypervariableregion)紧密连锁，而后者在人群中具有高度多态性，因此可以通过RFLP连锁分析进行诊断。2.临床分子生物学检验内容及其应用感染性基因病乙型肝炎病毒的分子生物学检验乙型肝炎病毒核酸的检验HBVDNA是病毒复制和传染性的直接标志。定量检测HBVDNA对于判断病毒复制程度、传染性大小、抗病毒药物疗效等有重要意义。PCR引物常根据其S、C、P和X基因中的高度保守序列来设计荧光定量PCR技术能准确地反映HBVDNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等，特异性高。支链DNA技术，核酸杂交技术等。丙型肝炎病毒的分子生物学检验2.临床分子生物学检验内容及其应用感染性基因病丙型肝炎病毒的核酸检测肝组织内HCVRNA检测可应用斑点核酸杂交技术，血清中HCVRNA检测多采用PCR、核酸杂交、bDNA、基因芯片、转录介导的扩增系统等技术。5′UTR区的序列最保守，种系变化程度及进化率很低，可用于区分主要基因型2.临床分子生物学检验内容及其应用感染性基因病埃博拉病毒的分子生物学检测2014年埃博拉病毒感染在西非引起高致死性出血热疫情流行，目前对该病毒缺乏特异性的疫苗和治疗方案，早期快速诊断能明显降低感染死亡率。EBOV引物设计必须兼顾各亚型的敏感性，避免其他类似出血热病毒干扰，目前一般选择EBOV高度保守的GP或NP作为扩增的靶标设计引物和探针，利用逆转录PCR和实时定量荧光PCR相结合的方法来进行检测。结核分枝杆菌的分子生物学检验2.临床分子生物学检验内容及其应用感染性基因病结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TBIS6110插入序列、染色体DNA的重复序列等。PCR-RFLP，real-timePCR，等技术均可2.临床分子生物学检验内容及其应用感染性基因病2.临床分子生物学检验内容及其应用禽流感的亚型目的基因错重PCR扩增2.临床分子生物学检验内容及其应用复杂性疾病（多基因，多因素）高血压的分子生物学诊断目前关于原发高血压相关的易感基因的研究现状：1号染色体位于1p36.1的ECE1基因以及1q42-q43的AGT基因是人类血压调节的候选基因。2号染色体2p25-p24是原发高血压的易感位点。3号染色体位于3q21-q25的AGTR1A基因以及3p14.1-q12.3是与原发高血压相关。4号染色体位于4p16.3的ADD1基因与盐敏感性原发性高血压相关。7号染色体位于7q22.1的CYP3A5基因与盐敏感性原发性高血压相关；位于7q36的NOS3基因与妊娠高血压相关。11号染色体研究提示位于11q的数量性状遗传位点与血压的调节相等。2.临床分子生物学检验内容及其应用复杂性疾病（多基因，多因素）肿瘤的基因诊断肿瘤基因诊断的常用方法PCR、RT-PCR，Southernblot杂交技术、Northernblot杂交技术，基因芯片，基因测序等。胃癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌等，在p53,ERras等基因上会有点突变。结肠癌、肾癌、乳腺癌、脑瘤等CD44，muc-1,VLA-4等基因的拼接会产生改变。组织特异性基因标志物2.临床分子生物学检验内容及其应用复杂性疾病（多基因，多因素）存在于肿瘤及其起源的正常细胞中，不存在于其他细胞。如CEAmRNA、AFPmRNA、PSAmRNA等血管生成因子,如血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。肿瘤基因诊断的常用方法PCR、RT-PCRSouthernblot杂交技术、Northernblot杂交技术基因芯片基因测序。2.临床分子生物学检验内容及其应用耐药性分析结核分枝杆菌的耐药性检测耐利福平分子机制：是由于其作用靶标—结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶β亚单位的编码基因（rpoB）突变所致。当rpoB中507~533位密码子的核心区域—耐利福平决定区(RRDR)发生突变时，结合分歧杆菌表现为耐药耐异烟肼分子机制：结核杆菌耐异烟肼与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因(katG)、烯酰基还原酶编码基因(inhA)、烷基过氧化氢酶还原酶编码基因(ahpC)、β2S酮酰基酰基运载蛋白合成酶编码基因(kasA)有关。主要是katG基因的点突变、缺失、插入。耐氨基糖苷类药物：rpsL基因发生突变耐吡嗪酰胺：pncA基因突变2.临床分子生物学检验内容及其应用细菌分型16SrDNA是细菌分型最常用的目标基因细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA。5SrRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍，分析较困难。而16SrRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高。3.临床分子生物学的问题以及标准化标准化临床实验室分子诊断现已成为临床检验各学科分支中最具发展潜力的领域,其涉及病原体核酸、人类基因和各种蛋白等大分子的测定,是临床疾病诊断中不可或缺的手段但在临床应用中,目前仍存在同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果的差异,这已成为时常困扰临床医师、患者以及实验室技术人员的普遍性问题。仪器设备、试