_高通量测序研究益生菌对小鼠肠道菌群的影响

2142017,Vol.38,No.01食品科学※营养卫生高通量测序研究益生菌对小鼠肠道菌群的影响曲巍1,2，张智1,*，马建章3,*，刘慧1，雅男1（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江农业工程职业学院，黑龙江哈尔滨150088；3.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江哈尔滨150040）摘 要：采用高通量测序技术分析复合益生菌对昆明雄性小鼠肠道菌群的影响。利用0.9mg/（g·d）青霉素钠灌胃建立肠道菌群失调小鼠模型。将50只小鼠随机分为5组：空白对照组、自然恢复组、复合菌液高、中、低3个剂量组（复合益生菌浓度分别为109、108、107CFU/mL）。0.2mL/（d·10g）连续灌胃14d后，收集小鼠粪便，采用高通量测序技术对各组小鼠粪便菌群进行分析。结果表明：复合菌液高剂量组小鼠肠道菌群物种多样性最高（ACE值为22101.63和Chao1值为13791.40），自然恢复组最低；另外，小鼠肠道中有益菌与致病菌比例在各组之间差异显著，复合菌液各剂量组中有益菌群的比例均大于自然恢复组，而致病菌比例最高的为自然恢复组（56.36%），因此复合菌液对小鼠的肠道菌群失调具有调节作用。关键词：益生菌；肠道菌群；高通量测序EffectofProbioticsonGutMicrobiotainMiceEvaluatedbyHigh-ThroughputSequencingQUWei1,2,ZHANGZhi1,*,MAJianzhang3,*,LIUHui1,YANan1(1.CollegeofForestry,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China;2.HeilongjiangAgriculturalEngineeringVocationalCollege,Harbin150088,China;3.CollegeofWildlifeResources,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China)Abstract:TheeffectofmixedprobioticculturesontheintestinalmicrobiotaofmaleKunmingmicewasanalyzedbyhigh-throughputsequencinginthisinvestigation.Ananimalmodelofintestinalmicrofloraimbalancewasestablishedbyintragastricadministrationofsodiumpenicillinto40mice,andtheseanimalswererandomlydividedintonaturalrecoverygroupandthreegroupsorallytreatedwithmixedprobioticculturesatlow,mediumandhighdoses.Besides,ablankgroupconsistingof10normalmicewassetupforcontrol.After14-dadministration,feceswerecollectedandtheintestinalmicrobiotaweredetectedbyhigh-throughputsequencing.Theresultsshowedthatthehighdosegrouphadthehighestdiversityofintestinalmicrobiota(ACE-index=22101.63;Chao1-index=13791.40)andtheintestinalmicrobiotainthenaturalrecoverygroupexhibitedthelowestspeciesdiversity.Inaddition,theresultsshowedthattheproportionsofbeneficialandpathogenicbacteriainthemouseintestinedifferedsignificantlyamongthefivegroups;theproportionsofbeneficialbacteriawerehigherinthethreetreatmentgroupsthaninthenaturalrecoverygroup,andthehighestproportionofpathogenicbacteria(56.36%)wasobservedinthenaturalrecoverygroup,suggestingthatmixedprobioticculturescouldregulateintestinalmicrobiotaimbalanceinmice.Keywords:probiotic;intestinalmicrobiota;high-throughputsequencingDOI:10.7506/spkx1002-6630-201701036中图分类号：Q507文献标志码：A文章编号：1002-6630（2017）01-0214-06引文格式：曲巍,张智,马建章,等.高通量测序研究益生菌对小鼠肠道菌群的影响[J].食品科学,2017,38(1):214-219.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201701036.[J].FoodScience,2017,38(1):214-219.(inChinesewithEnglishabstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201701036.收稿日期：2016-01-24基金项目：国家林业局大熊猫国际资金项目（SG1409）作者简介：曲巍（1982—），女，工程师，硕士研究生，主要从事食品加工与安全方面研究。E-mail：[e-mail]*通信作者：张智（1964—），女，教授，博士，主要从事生物转化，功能食品研究。E-mail：[e-mail]马建章（1937—），男，教授，博士，主要从事野生动物生态管理与自然保护方面研究。E-mail：[e-mail]※营养卫生食品科学2017,Vol.38,No.01215益生菌是一种能够平衡宿主肠道内菌群，并且可以产生活性物质，同时对宿主产生有益作用的微生物，是人类及动物肠道内尤为重要的生理菌，主要包括乳酸菌、链球菌、芽孢杆菌等[1]。近年来，随着生物技术的不断发展，关于益生菌的研究受到了越来越多领域的关注和重视。因其具有调节肠道、增强机体免疫力、产生生物活性物质等生理功能，备受人们青睐。复合益生菌是由几种不同的微生物以适当的比例进行组合所制成的制剂[2]。肠道是动物用来消化食物吸收营养的主要部位，同时也是一个巨大的细菌库。动物胚胎本处于无菌状态，但是出生后几小时，就可在其肠道内发现微生物，出生后10d左右，在其肠道内可逐渐形成定型菌群[3]。动物肠道内的菌群中有益微生物与有害微生物的种类及数量长期处于动态平衡的状态，肠道微生态才能得以维持[4]。肠道正常菌群具有促进营养消化与吸收、抵御外来病原菌的入侵和产生重要代谢产物以及生物活性成分等不可替代的作用[5-6]。若正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化，则肠道菌群的平衡就会失调，而对宿主肠道功能会产生不良影响。肠道微生态的破坏，是许多胃肠道疾病发病的主要原因[7-8]。双歧杆菌是大肠中的主要益生菌，可抑制人体有害细菌的生长繁殖，在抵抗病原茵的感染，抑制肠道腐败净化肠道环境等方面有着重要作用。嗜酸乳杆菌是人体胃和小肠内的主要益生菌，其在小肠中释放乳酸、乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，也可以释放双歧杆菌等其他益生菌生长的物质，也可以增加大肠内益生菌的数量、增强它们的生命力。植物乳杆菌厌氧或兼性厌氧，在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂，对致病菌有抑制作用；可维持肠道内菌群平衡，并促进营养物质吸收。肠道中微生物的变化与粪便菌群的构成密切相关，因此对粪便菌群多样性的研究可以帮助人们深入了解肠道菌群的变化[9]。传统的方法主要是通过对微生物的选择性培养，再进行分型鉴定。但是，对于许多微生物现阶段能够掌握的信息仍不完善（如其在自然环境中的生存状况、生理特性等），导致研究人员对菌群数量和多样性的低估，因此传统培养技术的准确率低、局限性大，限制人类对微生物的全面了解[10]。而肠道菌群中仅有1%～10%的细菌为非培养型菌[11-12]，因此，近年来在各研究领域中更多地采用分子生物技术来对微生物群落进行分析，其中主要方法有聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）[13]、荧光原位杂交[14]、变性梯度凝胶电泳[15]、末端限制性片段长度多态性[16]、构建克隆文库[17]等。相对而言，高通量测序技术对微生物群落结构的研究具有准确定量、实时检测等较为明显的优势[18-19]。目前，高通量测序技术已在各种分子生物学领域被广泛应用[20]，在人体微生物研究方面等多个领域均有应用。其在肠道菌群研究方面的应用，可帮助研究人员更加全面地了解肠道菌群的构成。青霉素钠为广谱抗菌类药物，对于由敏感细菌引起的感染具有一定的治疗作用。其对链球菌，葡萄球菌、肠球菌、梭状芽孢杆菌等均具有一定的抗菌作用，而革兰氏阴性需氧或兼性厌氧菌对其敏感性差。因此，本实验通过抗生素干扰（青霉素钠）构建肠道菌群失调小鼠模型，对小鼠进行复合益生菌液灌胃实验，采用高通量测序技术对小鼠粪便菌群进行分析，以探究复合益生菌对肠道菌群的影响。1材料与方法1.1动物、材料与试剂1.1.1动物清洁级雄性昆明小鼠，体质量18～22g，由黑龙江省中医药大学药物评价中心提供。1.1.2材料与试剂婴儿双歧杆菌Bbi-01、嗜酸乳杆菌La-02及植物乳杆菌Lp-01由东北林大实验室保存；注射用青霉素钠哈药集团制药总厂；粪便基因组DNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司。1.2仪器与设备YXQG02手提式压力蒸汽灭菌器山东新华医疗器械股份有限公司；SW-CJ-1G超净工作台江苏净通净化设备有限公司；DL-6M型立式离心机湖南星科科学仪器有限公司；YQX-Ⅱ厌氧培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司。1.3方法1.3.1复合菌液的制备本实验选择3种益生菌复合，可在体内消化系统环境有氧和厌氧时均有可发挥调节的作用。将婴儿双歧杆菌Bbi-01、嗜酸乳杆菌La-02及植物乳杆菌Lp-01分别于MRS液体培养基37℃厌氧培养24h，4000r/min离心10min除去上清液，菌体沉淀重悬于生理盐水中，分别配制成菌悬液，并按菌液浓度1∶1∶1比例混合后制成107、108、109CFU/mL3个浓度的复合菌液。1.3.2动物分组处理从50只清洁级雄性昆明小鼠中随机抽10只作为空白对照组，其余小鼠用青霉素钠（0.9mg/（g·d），以体质量计）灌胃建模，连续灌胃7d。当小鼠出现腹泻、背毛失去光泽、行动迟缓等症状时，建模成功[21]。建模成功后，随机分为4组，每组10只，即为：自然恢复组、复合菌液高、中、低3个剂量处理组。饲养期间，小鼠自由取食（饮用灭菌水）。按照表1的方案，连续灌胃14d。2162017,Vol.38,No.01食品科学※营养卫生表1动物分组和灌胃方案Table1Animalgroupingandintragastricadministrationproject组别灌胃量/（mL/10g）灌胃液空白对照组0.2生理盐水自然恢复组0.2生