引物设计的原理与方法

PCR引物设计的原理及方法阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都610014)摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。关键词：PCR引物原理方法NCBIPrimerPremier5.0PCRprimerdesignprincipleandmethodYanZhenxin(sichuanUnivercity,Lifesciencecollegecellbiologychengdu610014)Abstract:WhenPCRtechnologywasfind,PCRhaschangedalloftheprograminresearchofbiology.ThedesignofprimeristhefriststepofPCR.ItisrelationtothefateofPCR.Therearesomeprincipalsmustbeobey:dipolymerandhairpinstructuremustbeavoidbetweendifferentprimers.TheDNApolymerizationreactionshouldnotbetriggeredatthewrongsite.Therefore,therearemoreandmoremethodsofdesignprimer,includetheprofessionalsoftwaresandprofessionalwebsite.Keyword:PCRprimerprincipleNCBIPrimerPremier5.0聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction。PCR)是20世纪后期发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。1PCR引物设计的原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，其中在扩增的DNA片断5'端的引物对应于有意链DNA序列，3'端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。我们先看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。我们可以归纳一下几条PCR引物的设计原则：1.1避免二聚体与发夹结构引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物设计中，特别需要判断引物互补配对情况是否影响模板与引物的结合，这需要估计模板与引物结合及引物配对结合的自由能。A、T由2个氢键连接，G、C由3个氢键连接。一般来说。出现3个碱基的序列互补便有些危险，尤其在引物3末端。若3末端出现3个碱基的序列互补或碱基为GC的2个碱基的序列互补。只好将这个引物放弃，重新设计[3]。1.2不同物种时避开mRNA的5'和3'末端非翻译区序列在选择用来扩增不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5'和3'末端非翻译区序列。不同物种mRNA的5'和3'末端非翻译区序列可能没有任何的同源性[4]，如果选择的不同物种DNA序列同源性非常低，那么就无法保证获得一段或几段高度保守的序列，将会为引物设计带来很大的困扰，特别是在BLAST比对和PrimerPremier5.0软件进行评价分析时，各项参数指标将会远远达不到要求，无法充分保证引物设计的高度敏感性和特异性，更会为后期的RT-PCR试验带来诸多麻烦。1.3不同类型引物设计的特别原则特异性引物的错配率很低，甚至为零，其中，RT-PCR引物最好跨过1个以上的内含子序列；非特异性引物的扩增位点数要在合适范围内；简并性引物的简并性要合适等。1.4实现以上原则的注意事项（1）引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃不适于TaqDNA聚合酶进行反应[5]。（2）引物序列在模板内应当没有较高相似性片段，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错配[5]。（3）引物3'端的末位碱基对TaqDNA酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A[6,7]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[5]。（4）引物序列的GC含量一般为40%-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[5]。（5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4（G+C）+2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法[5]。（6）△G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端△G值较低（绝对值不超过9），而5'端和中间△G值相对较高的引物。引物的3'端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[8]。（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。（8）对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。2引物设计的具体方法2.1NCBI搜核苷酸序列登录可以从GenBank中获取基因序列作为模板。根据试验要求来确定需要扩增的DNA序列，并知道其编码结构基因区序列。具体方法如下：在Search对话框中选择Nucleotide在对话框中填人所要查找的Nucleotide名称，如输入CPT，点击Go即得到与CPT相关的许多序列信息，从中选择物种相近的1个，然后将其序列与GenBank中相关序列进行比较[9]。2.2序列同源性分析与比较运用DNAStar等相关软件进行序列比较，具体步骤为打开DNAStar，点击MegAlign，在File菜单中选择EenterSequences，在查找范围对话框中将上述获得的目的序列复制，点击Done，软件就自动把输入的所有序列进行比较，确定同源性区域。找出同源性较高的区域，在该区域内选择出引物设计的模板旧，通过以上的计算机操作便可以完成图1所示的序列编辑与处理以及引物设计位置的确定。2.3使用PrimerPremier5.0设计引物PrimerPremier5.0是用来设计最适合引物的应用软件，利用其高级引物功能，进行引物数据库搜索、巢式引物设计、引物编辑和分析等，可以设计出有高效扩增能力的理想引物，也可以设计出用于扩增长达5Okb以上的PCR产物的引物序列。该软件主要由GeneBank序列编辑、Primer引物设计、Align序列比较、Enzyme酶切分析和Motif基序分析等几个主要功能板块组成。2.4BLAST比对首先登录．gov，然后点击BLAST；其次进入Nucleotideblast，在Search对话框中将上述获得的序列复制粘贴，点击BLAST，GenBank将自动把输入的序列与序列资源库中所有相关序列进行比较。在比较结果中列出所有的相关序列比较的情况，当然也包括同一物种不同长度及不同物种已在GenBank中登记的相关基因序列的综合比较。2.5筛选后引物的综合评价筛选后引物首先可以在软件上进行分析评价，设计引物的软件一般要具备引物分析评价功能。各种软件侧重点有所不同，在引物分析评价功能方面，通过综合比较，以Oligo6．0软件最优秀，可快速设计出高成功率的引物[10]。最后，可以通过PCR扩增后的凝胶成像系统进行试验验证：一是PCR产物的量以及PCR扩增的特异性和效率；二是是否会形成引物二聚体条带；三是以DNA为模板设计引物时，PCR扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。3引物设计的展望和相关思考引物设计不仅是PCR的第1步，更是使其成功扩增的关键一步，好的引物不但能避免背景和非特异物的产生，而且也能识别cDNA和基因组模板[11]。由于基因克隆成功关键步骤就在于PCR反应，扩增产物必须要具备高效性、特异性[12]，所以只有科学严谨地抓住引物设计的每个环节，才会得到最理想的结果。当今，随着生物信息学蓬勃的发展趋势。在以后的分子生物学探索中，PCR技术将会被研究的愈来愈透彻、愈来愈深入，核苷酸引物设计也必将趋于简便、灵活、系统、完善。参考文献：[1]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M]．北京:中国协和医科大学出版社,1999：467-477．[2]艾得希HA.PCR技术---DNA扩增的原理与应用[M].田西,张基增,俞守义,等译.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1991．[3]王艳秋，张培军.PCR引物设计[J]．海洋科学，1995(5)：9-10．[4]磨美兰，甘书钻．动物传染病研究中PCR引物设计的技巧及相关软件介绍[J].广两农业生物科学，2008，27(s1)：72—75．[5]贺林.解码生命-人类基因组计划和后基因组计划[M].北京：科学出版社,2000,346-348.[6]杨发青,谢超,钱令嘉.DNA查找和分析程序SeqFinder的设计与开发[M].医学情报工作,2002,1:17-18.[7]王清祺,孙砚,刘曼西.一款方便实用的分子生物学软件E-KitforPlasmid[M].生物技术,2003,13.4:33-36.[8]Rychlik,W,Rhoads,R.E.'Acomputerprogramforchoosingoptimaloligonucleotidesforfilterhybridization,sequencingandinvitroamplificationofDNA[J].NucleicAcidsRes.1989,17:8543-8551.[9]磨美兰,甘书钻.动物传染病研究中PCR引物设计的技巧及相关软件介绍[J].广两农业生