原子力显微镜的原理及应用

原子力显微镜的原理及应用北京大学生物医学工程05硕喻敏一、引言1985年Binnig与斯坦福大学的C.F.Quate和IBM苏黎士实验室的ChristophGerber合作推出了原子力显微镜(AtomicForceMicroscopy，简称AFM),[1]这是一种不需要导电试样的扫描探针型显微镜。这种显微镜通过其粗细只有一个原子大小的探针在非常近的距离上探索物体表面的情况，便可以分辨出其他显微镜无法分辨的极小尺度上的表面细节与特征。由于它的出现，直接观测微观世界的大门被打开了。这种显微镜能以空前的高分辨率探测原子和分子的形状，确定物体的电、磁与机械特性，甚至能确定温度变化的情况。使用这种显微镜时无需使试样发生变化，也无需使试样受破坏性的高能辐射作用。1AFM基本原理总合起来讲，原子力显微镜的工作原理就是将探针装在一弹性微悬臂的一端，微悬臂的另一端固定，当探针在样品表面扫描时，探针与样品表面原子间的排斥力会使得微悬臂轻微变形，这样，微悬臂的轻微变形就可以作为探针和样品间排斥力的直接量度。一束激光经微悬臂的背面反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微小变形，这样就实现了通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。在原子力显微镜（AtomicForceMicroscopy，AFM）的系统中，可分成三个部分：力检测部分、位置检测部分、反馈系统（见图1）。1．1力检测部分在原子力显微镜（AFM）的系统中，所要检测的力是原子与原子之间的范德华力。所以在本系统中是使用微小悬臂（cantilever）来检测原子之间力的变化量。微悬臂通常由一个一般100~500μm长和大约500nm~5μm厚的硅片或氮化硅片制成。微悬臂顶端有一个尖锐针尖，用来检测样品－针尖间的相互作用力。这微小悬臂有一定的规格，例如：长度、宽度、弹性系数以及针尖的形状，而这些规格的选择是依照样品的特性，以及操作模式的不同，而选择不同类型的探针。以下是一种典型的AFM悬臂和针尖：1．2位置检测部分在原子力显微镜（AFM）的系统中，当针尖与样品之间有了交互作用之后，会使得悬臂cantilever摆动，所以当激光照射在微悬臂的末端时，其反射光的位置也会因为悬臂摆动而有所改变，这就造成偏移量的产生。在整个系统中是依靠激光光斑位置检测器将偏移量记录下并转换成电的信号，以供SPM控制器作信号处理。上图是激光位置检测器的示意图。聚焦到微悬臂上面的激光反射到激光位置检测器，通过对落在检测器四个象限的光强进行计算，可以得到由于表面形貌引起的微悬臂形变量大小，从而得到样品表面的不同信息。1．3反馈系统在原子力显微镜（AFM）的系统中，将信号经由激光检测器取入之后，在反馈系统中会将此信号当作反馈信号，作为内部的调整信号，并驱使通常由压电陶瓷管制作的扫描器做适当的移动，以保持样品与针尖保持一定的作用力。AFM系统使用压电陶瓷管制作的扫描器精确控制微小的扫描移动。压电陶瓷是一种性能奇特的材料，当在压电陶瓷对称的两个端面加上电压时，压电陶瓷会按特定的方向伸长或缩短。而伸长或缩短的尺寸与所加的电压的大小成线性关系。也就是说，可以通过改变电压来控制压电陶瓷的微小伸缩。通常把三个分别代表X，Y，Z方向的压电陶瓷块组成三角架的形状，通过控制X，Y方向伸缩达到驱动探针在样品表面扫描的目的；通过控制Z方向压电陶瓷的伸缩达到控制探针与样品之间距离的目的。原子力显微镜（AFM）便是结合以上三个部分来将样品的表面特性呈现出来的：在原子力显微镜（AFM）的系统中，使用微小悬臂（cantilever）来感测针尖与样品之间的相互作用，这作用力会使微悬臂摆动，再利用激光将光照射在悬臂的末端，当摆动形成时，会使反射光的位置改变而造成偏移量，此时激光检测器会记录此偏移量，也会把此时的信号给反馈系统，以利于系统做适当的调整，最后再将样品的表面特性以影像的方式给呈现出来。2．原子力显微镜的工作模式原子力显微镜的工作模式是以针尖与样品之间的作用力的形式来分类的。主要有以下3种操作模式:接触模式(contactmode)，非接触模式(non-contactmode)和敲击模式(tappingmode)。2．1接触模式从概念上来理解，接触模式是AFM最直接的成像模式。正如名字所描述的那样，AFM在整个扫描成像过程之中，探针针尖始终与样品表面保持亲密的接触，而相互作用力是排斥力。扫描时，悬臂施加在针尖上的力有可能破坏试样的表面结构，因此力的大小范围在10-10～10-6N。若样品表面柔嫩而不能承受这样的力，便不宜选用接触模式对样品表面进行成像。2．2非接触模式非接触模式探测试样表面时悬臂在距离试样表面上方5～10nm的距离处振荡。这时，样品与针尖之间的相互作用由范德华力控制，通常为10-12N，样品不会被破坏，而且针尖也不会被污染，特别适合于研究柔嫩物体的表面。这种操作模式的不利之处在于要在室温大气环境下实现这种模式十分困难。因为样品表面不可避免地会积聚薄薄的一层水，它会在样品与针尖之间搭起一小小的毛细桥，将针尖与表面吸在一起，从而增加尖端对表面的压力。2．3敲击模式敲击模式介于接触模式和非接触模式之间，是一个杂化的概念。悬臂在试样表面上方以其共振频率振荡，针尖仅仅是周期性地短暂地接触/敲击样品表面。这就意味着针尖接触样品时所产生的侧向力被明显地减小了。因此当检测柔嫩的样品时，AFM的敲击模式是最好的选择之一。一旦AFM开始对样品进行成像扫描，装置随即将有关数据输入系统，如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰顶之间的最大距离等，用于物体表面分析。同时，AFM还可以完成力的测量工作，测量悬臂的弯曲程度来确定针尖与样品之间的作用力大小。2．4三种模式的比较接触模式（ContactMode）：优点：扫描速度快，是唯一能够获得“原子分辨率”图像的AFM垂直方向上有明显变化的质硬样品，有时更适于用ContactMode扫描成像。缺点：横向力影响图像质量在空气中，因为样品表面吸附液层的毛细作用使针尖与样品之间的粘这力很大横向力与粘着力的合力导致图像空间分辨率降低，而且针尖挂擦样品会损坏软质样品（如生物样品，聚合体等）。非接触模式（Non-ContactMode）：优点：没有力作用于样品表面。缺点：由于针尖与样品分离，横向分辨率低；为了避免接触吸附层而导致针尖胶粘，其扫描速度低于TappingMode和ContactModeAFM。通常仅用于非常怕水的样品，吸附液层必须薄，如果太厚，针尖会陷入液层，引起反馈不稳，刮擦样品。由于上述缺点，on-contactMode的使用受到限制。轻敲模式（TappingMode）：优点：很好的消除了横向力的影响。降低了由吸附液层引起的力，图像分辨率高，适于观测软、易碎、或胶粘性样品，不会损伤其表面。缺点：比ContactModeAFM的扫描速度慢。3、AFM在生物学研究中的应用3．1原子力显微镜对生物细胞表面形态观测.一般认为，AFM能够在自然环境中直接观测生物样品的表面结构，而且避免复杂的制备过程，以及电子束辐射所带来的样品损伤。但实际情况并非完全如此。AFM对生物医学样品制备，同样也有一定的要求。包括:表面平整，高度起伏≤10一20μm;表面有一定的硬度;基底面平滑，如用新鲜解离的云母片等;对于较大的颗粒、细胞，可用盖玻片、塑料片等;样品在基底表面要求相对均匀、分散等。客观地讲，相对于电镜复杂的生物样品制备过程来说，原子力显微镜的生物样品制备过程要简单一些。但遗憾的是，没有一种普遍适用的方法，能够解决原子力显微镜所有的生物医学样品的制备问题。因此，一般情况下，都需要科研人员自己动手制备符合AFM技术要求的样品，以获得满意的观察效果。游离细胞样品制备过程大致步骤如下:首先提取细胞，2.5%戊二醛固定;同时制备新鲜解离的云母片，用双面胶固定于基底表面;然后将固定细胞滴加于云母表面，用氮气吹干并展平;最后用接触式或轻敲式进行细胞的表面形态观测。活的培养细胞样品制备过程大致步骤如下:事先将培养皿或盖玻片用多聚赖氨酸进行处理，然后将细胞培养于培养皿或盖玻片上，检查前将培养皿或盖玻片制成小于1x1cm的小片;将指甲油滴加于AFM液体池底部，小片的无细胞面沾到指甲油上，而小片的有细胞面上滴加培养液;待指甲油干后，液体池中充人培养液，置于AFM的扫描器上，即可进行细胞表面形态的成像观测。AFM对活体细胞的成像效果还很不理想，这主要是因为细胞膜表面比较柔软，与基底的固定较弱，探针的压力会使探针和细胞表面的接触面积大大增加，从而损伤细胞或造成细胞的漂移。0'Reily等利用AFM对一定数量的血红细胞表面形态及三维结构进行了观测和图像分析，从而得出细胞的厚度、宽度、表面积以及体积等量化数。对于活细胞，也可以在AFM的液体池中进行动态的观察。通过液体池的进液孔可随时注入不同的化合物溶液，改变活细胞的液体环境(如离子浓度、pH值、温度、湿度等)进行动态的观测。Jena等“利用AFM对感染病毒后细胞表面形态的改变、造骨细胞在加人底物(钻铬、钦、钦钒等)后细胞形态和细胞弹性的变化、GTP对胰腺外分泌细胞囊泡高度的影响进行研究。黄益民等7利用原子力显微镜对自由基损伤的红细胞膜表面精细结构研究，直接观察到了自由基的损伤，以及加女贞子保护后，对红细胞膜分子形貌学的影响。如果要对一些生物医学组织样品进行AFM表面形态成像观测，样品制备过程大致如下:选取组织表面较为平整的部位，剪成0.5x0.5cm小块，观测面朝上，展平后贴在盖玻片上;滴加固定液于样品表面上，静置30min左右;用三蒸水冲洗去固定液中的溶质所形成的结晶;将盖玻片置于AFM的扫描器上，进行成像观测。一般来说，组织样品进行AFM的表面形态成像效果还比较满意。AFM观察细胞表面形态结构分辨率还不够理想。这主要是由于细胞膜表面太软，探针的压力(无论是接触式，还是轻敲式)会使探针和样品表面的接触面积增大，从而使分辨率降低。AFM观察细胞表面形态结构的分辨率一般只能维持在nm到μm之间。如果样品制备不好，仪器状况调整不佳，操作人员技术不够熟练，那么AFM的分辨率还要低一些。3.2原子力显微镜对生物大分子的结构及其它性质的观测研究原子力显微镜目前已广泛应用于蛋白质、核酸、DNA,磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及有机化合物在空气或溶液中的形态观测研究。张英鸽等“用AFM对乙酞胆碱醋酶分子进行显微成像。林璋、白春礼等[6]用AFM进行亚精胺诱导DNA凝聚有序性的研究。Rief等[7]用AFM研究了不同大小的力对单个葡聚糖分子的影响，其中可逆的构象变化已经得到分子动力学计算的证实。胡钧等进行了人工操纵病毒的原子力显微镜研究，首次实现了复杂的体系—一种线性噬菌体病毒的人工拉直与定向，并利用原子力显微镜对拉直前后的病毒进行了观察与测量。用AFM对生物大分子进行形态结构观察时，样品制备也很重要。蛋白质样品制备过程有两种方法，一种是蛋白质吸附固定法:首先将云母裁成lx1cm的小片，用双面胶固定于AFM基底上，制备新鲜裂解的云母表面;将一定浓度的蛋白溶液滴加于云母表面，用氮气将其展平，吹干，蛋白便可吸附于云母表面;将液体池置于AFM的扫描器上，即可进行细胞表面形态的成像观测。该方法简便易行，可满足一般成像的要求。缺点是蛋白质固定不一定牢固，可能会出现脱落或拖动现象。另一种是蛋白质共价固定法:利用蛋白质分子上的氨基与疏基丙酸的狡基形成肤键连接的原理，进行蛋白质的固定。该方法固定比较牢固。缺点是方法复杂，费时费力。固定好的样品置于AFM的扫描器上，即可进行生物大分子表面形态结构的成像观测。如果是DNA类的样品，其制备过程大致如下:首先将根据实验目的，稀释原液;然后取适量稀释液滴加于新鲜裂解云母表面，氮气展平，吹干。固定好的样品置于AFM的扫描器上，即可进行生物大分子表面形态结构的成像观测。目前,AFM已广泛应用于对生理生化反应中蛋白质、核酸等生物大分子的形态或功能的动态研究。在此基础上还可以进行分子水平的热力学和动力学的研究。研究生物大分子的生理生化过程，是目前AFM在生命科学中应用最多的领域