TAKARA上机说明书SYBR-NO.RR820A

研究用CodeNo.RR820A说明书SYBR®PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)v201211Da目录内容页码●制品说明1●试剂盒原理1●制品内容2●试剂盒外必备主要试剂和仪器2●保存2●使用注意2●操作方法3●实验条件的选择8●附录9●质量标准10●关联产品11●制品说明本制品是采用SYBR®GreenI*嵌合荧光法进行RealTimePCR的专用试剂。制品中含有RealTimePCR反应的最适浓度SYBR®GreenI，是一种2×浓度的PremixType试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。本制品中还添加了TliRNaseH(耐热性RNaseH)，以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。本制品Buffer经过改良，使反应特异性比SYBR®PremixExTaq(TliRNaseHPlus)（CodeNo.RR420A）更高。能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量。本Buffer和HotStart法用DNA聚合酶TaKaRaExTaqHS组合使用，可以进行重复性好、可信度高的RealTimePCR解析。特长：1.适用于RealTimePCR反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。2.在2×浓度的Premix中，预先混有SYBR®GreenI，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行RealTimePCR反应，操作简单方便。3.DNA聚合酶使用了TaKaRaExTaqHS，可以进行HotStart法PCR反应，再与TakaraBio公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。4.在2×浓度的Premix中，预先添加了耐热性RNaseH(TliRNaseH)，可以最大限度抑制以cDNA作为模板进行PCR反应时，由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。*：TakaraBio使用SYBR®GreenI作为研究试剂已得到MolecularProbesInc.的许可。SYBR®为MolecularProbesInc.的注册商标。●试剂盒原理本制品使用了改良后的TaKaRaExTaqHS进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBRGreenI的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。1．PCRPCR法是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增DNA达100万倍以上。本制品中的DNA聚合酶由于使用了TaKaRaExTaqHS，从而抑制在调制反应液等低温条件下由引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。2．嵌合荧光检测法SYBR®GreenI与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBR®GreenI荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。具体原理见下图。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR®GreenI与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。-1-2.引物退火3.延伸反应1.热变性●制品内容（50μl反应×200次）SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×Conc.）*11.0ml×5支ROXReferenceDye（50×Conc.）*2200μl×1支ROXReferenceDyeII（50×Conc.）*2200μl×1支*1内含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，SYBR®GreenI等。*2只使用在LifeTechnologies等公司的RealTimePCR扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。AppliedBiosystems7300Real-TimePCRSystem和StepOnePlusTM使用ROXReferenceDye，7500Real-TimePCRSystem和7500FastReal-TimePCRSystem使用ROXReferenceDyeII。ThermalCyclerDiceRealTimeSystemII、LightCycler®/LightCycler®480System(RocheDiagnostics)或CFX96™Real-TimePCRDetectionSystem(Bio-Rad)等RealTimePCR扩增仪不必使用。●试剂盒外必备主要试剂和仪器1.试剂PCR引物：引物设计请参考“附录1.”。灭菌蒸馏水2.仪器特定的反应板或微量离心管微量移液器和枪头（高压灭菌）RealtimePCR扩增仪（授权仪器）适用的RealTimePCR扩增仪AppliedBiosystems7300/7500Real-TimePCRSystem、7500FastReal-TimePCRSystem、StepOnePlus™Real-TimePCRSystem（LifeTechnologies）LightCycler®/LightCycler®480System（RocheDiagnostics）CFX96TMReal-TimePCRDetectionSystem（Bio-Rad）ThermalCyclerDiceRealTimeSystemII（CodeNo.TP900/TP960）注：使用SmartCycler®System/SmartCycler®IISystem(Cepheid)时，建议使用SYBR®PremixExTaq(TliRNaseHPlus)(CodeNo.RR420A)。●保存：4℃。注意：1.4℃可保存6个月。2.避光保存，避免污染。3.干冰运输，到货后4℃避光保存。4.长期保存请置于-80℃，勿存于-20℃。产品融化后请于4℃保存，并在6个月内用完。●使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1．使用时请上下颠倒轻轻均匀混合，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应不足。a)请勿涡旋振荡混匀。b)SYBR®PremixExTaqII(2×conc.)在-80℃存放可能会产生白色或淡黄色的沉淀，可用手握缓慢溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。c)沉淀会导致溶液成分不均匀，使用前务必充分混匀试剂。2．配制反应液时，试剂请于冰上放置。3．本制品中含有荧光染料SYBR®GreenI，配制PCR反应液时应避免强光照射。-2-4．反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。●操作方法*请按照不同仪器的操作手册提供的方法操作。◆应用AppliedBiosystems7300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem和StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem的操作方法1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×）10.0μl25.0μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.8μl2.0μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）0.8μl2.0μl0.4μM*1ROXReferenceDye（50×）orROXReferenceDyeII（50×）*20.4μl1.0μl1×DNA模板*32.0μ4.0μldH2O（灭菌蒸馏水）6.0μl16.0μlTotal20.0μl*450.0μl*4*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2ROXReferenceDyeII（50×）比ROXReferenceDye（50×）浓度低，使用ABI7500/7500FastReal-TimePCRSystem时，请使用ROXReferenceDyeII（50×）。使用ABI7300和StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem时，请使用ROXReferenceDye（50×）。*3在20μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2StepRT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。*4按照各仪器推荐体系进行反应液配制。2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。ABI7300/7500和StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Reps：195℃30秒Stage2：PCR反应Reps：4095℃5秒60℃30～34秒*Dissociationstage*使用StepOnePlusTM时请设定在30秒。使用7300时请设定在31秒。使用7500时请设定在34秒。-3-ABI7500FastReal-TimePCRSystem两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性Reps：195℃30秒Stage2：PCR反应Reps：4095℃3秒60℃30秒MeltCurveStage◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。3.实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法请参考仪器的操作手册。◆应用LightCycler®/LightCycler®480SystemRealTimePCR扩增仪的操作方法1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×）10.0μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.8μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）0.8μl0.4μM*1DNA模板（100ng）*22.0μldH2O（灭菌蒸馏水）6.4μlTotal20.0μl*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2StepRT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。-4-两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性95℃30秒20℃/秒1CycleStage2：PCR反应95℃5秒20℃/秒60℃20秒20℃/秒40CyclesStage3：融解曲线分析95℃0秒20℃/秒65℃15秒20℃/秒95℃0秒0.1℃