酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用ppt课件

第四节酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用其应用主要包括以下几个方面：•药物含量（活性）测定•宿主蛋白残留检测•抗生素残留检测•杂质检测•污染物检测•药物原材料检测•药物掺假检测1一、GLP-1活性检测CyclicAdenosineMonophosphate(cAMP)ELISAKit2GLP-1GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素，它通过与GLP-1受体(GLP-1R)结合发挥作用1）GLP-1可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃排空来降低血糖2）GLP-1还有减缓β细胞凋亡，促进其再生的独特作用3）GLP-1还能减慢胃排空速度，通过作用下丘脑，抑制食欲。3•GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路•胰岛成熟β细胞的GLP-1受体偶联Gs，活化腺苷酰环化酶，产生cAMP，后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰岛素基因转录和胰岛素原生物合成，可降低胰高血糖素浓度并抑制胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度。4PKACa2+NFAT-PNFATCalcineurin报告基因检测原理5试验原理•采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被cAMP特异性抗体，样品中cAMP将和标准HRP-cAMP竞争结合微孔条上cAMP特异性抗体，用TMB底物显色，吸光值与样品中cAMP的含量成负相关。•以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度，求得供试品相对生物活性。6操作程序：1、取微孔板条，加入cAMP特异性抗体，50ul/孔，室温1h;2、洗涤后，向不同孔中分别cAMP、对照或细胞裂解上清品（样品），100ul/孔；3、向孔中加入HRP-cAMP，50ul/孔，室温作用2h；4、洗涤后，向孔中加入TMB溶液，200ul/孔，室温作用30min；5、向孔中加入终止液，100ul/孔，测定OD450nm/570nm7数据与结果1.标准曲线的绘制：（1）测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值，并分别计算平均值；（2）以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度；对照品EC50；测试样EC502.数据处理：供试品相对生物活性（%）=对照品EC50/供试品EC50100%其中：对照品和供试品的EC50分别表示对照品和测试样的半效量的浓度。四参数方程中的C值即相当于半效量的浓度(EC50)。8典型的测定结果及回归曲线xaxis0.11101001000100005000150002500035000Graph#1y=((A-D)/(1+(x/C)^B))+D:ABCDR^2Plot#1(STd:ConcentrationvsMeanValue)39559.981.07816.0026571.4050.999Plot#2(100%:ConcentrationvsMeanValue)38463.371.3115.5647742.070.999Plot#3(50%:ConcentrationvsMeanValue)38642.451.5431.6327942.7390.999Plot#4(150%:ConcentrationvsMeanValue)38171.11.34312.6557056.6770.996910二、宿主蛋白（HCP）残留检测CygnusF550CHOHCPELISAKit11宿主细胞蛋白污染物•CHO宿主蛋白残留•E-coli宿主蛋白残留•酵母菌宿主蛋白残留•HEK293宿主蛋白残留12•2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱•将2DGel上的全蛋白转移至膜上，用多克隆抗体孵育后进行WesternBlot化学发光检测，以确认多克隆抗体能够与哪些宿主细胞蛋白结合•通过WesternBlot检测结果（多抗能检测到的HCP数量）与2D膜上检测结果（总HCP数量）的比较，得出用于评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的MatchRate评估HCP定量用多克隆抗体的特异性1314试验原理•采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上预包被抗CHOCHP多抗，免疫反应构成为夹层式结构：固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后清洗酶标板去除未结合反应物，添加TMB底物显色，吸光值与样品中CHO宿主蛋白的含量成正相关。15检测步骤：（1）于每个反应孔中，加入100μL抗CHOHCP多抗-HRP；（2）从标准蛋白液、对照和样品中吸取50μL上清加入到已标记好的反应孔中；180rpm下室温、振荡培养2h；（3）弃去孔内溶液，每孔加350μL洗涤液，重复洗涤4次；（4）于每个反应孔中，加入100μLTMB底物溶液，于室温孵育30min；（5）于每个反应孔中，加入100μL终止液；依序读取OD450/650nm吸收值(空白对照孔调零)。（6）数据处理：根据测定每孔标准液吸光值绘制四参数逻辑曲线，然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。161718192021ELISA法研究药物作用靶点（GPⅡb/Ⅲa受体）•实验原理•根据ELISA实验原理，先在96孔板上包被纤维蛋白原，然后同时加入GPIIb/IIIa受体和待测样品，再加酶标抗体与GPIIb/IIIa受体结合，最后加入底物，酶作用于底物显色，在405nm测得OD值，OD值与GPIIb/IIIa受体量成正比。如果样品与GPIIb/IIIa受体结合，就会降低纤维蛋白原与受体的结合，导致所测的OD值降低。22•实验步骤：•首先将纤维蛋白原（10μg/ml）用bufferA（0.1MNa2CO3,PH9.5）包被于96孔板上（100μl/well）（空白对照:不包被纤维蛋白原），4°C孵育过夜；•TACTS（0.02MTris-HCl,PH7.5，0.15MNaCl，1mMCaCl2,0.02%NaN3,0.05%Tween20）冲洗一次，每孔200μl，3min；用含1%BSA的TACTS在37°C封闭1h（200μl/well）,TACTS洗三次；•整合素αIIbβ3（20μg/ml、50μL/well）加一定浓度的待测样品50μl作为样品组；加孵育液做阴性对照组；37°C下孵育2h；•TACTS洗三次；加一抗（鼠抗人CD61抗体，含0.5%BSA,TACTS稀释，1:2000(体积比)，100μL/孔）37°C下孵育1h；23•TACTS洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG，含0.5%BSA,TACTS稀释，1:1000，100μL/孔），37°C下孵育1h；•TACTS洗三次，加底物（对硝基苯磷酸二钠溶液(PNPP)1mg/ml，用bufferB溶解，200μL/well），37℃下孵育30min；加入50μL3MNaOH(称0.6g加5ml蒸馏水)终止反应；5min内405nm波长下检测吸光度。24•数据处理•通过以下公式计算抑制率：[(X−Y)/(X-Z)]×100%。X代表生理盐水组OD值；Y代表样品组OD值；Z代表空白对照组OD值。实验结果都用均数±标准差（±s）表示，采用t检验进行单因素方差分析。p0.05界定为具有统计学意义，所有数据处理均使用GraphPadPrism6软件(GraphPadSoftware，美国)。25•溶液配制及注意事项（60well大概用量）1.bufferA：0.1MNa2CO350ml：取固体0.53g溶液50ml蒸馏水中，调PH9.5.2.TACTS洗脱液（需300ml）：定容100ml，pH7.5，Tris-HCl：0.2423g；NaCl：0.8766g；NaN3：200μL；Tween20:50μL；CaCl2:0.0222g。孵育液（50ml）：TACTS加0.5%BSA封闭液（20ml）：TACTS加1%BSA3.受体αⅡbβ3（4ml）：配制1.63mg/ml母液,受体使用的终浓度为20μg/ml。4.一抗（8ml）：1:2000；二抗（8ml）：1:10005.样品配制：不溶的样品加DMSO全溶，终浓度不超0.5%6.受体，抗体，样品均用孵育液稀释。267.bufferB（底物缓冲液）：定容100ml，PH9.5,二乙醇胺：105μl；MgCl2：10.175mg8.PNPP对光敏感，现配现用，用bufferB溶解9.配制的纤维蛋白原浓度越高储存越稳定，37℃水浴锅加热包被液溶解，储存Fg1mg/ml时较稳定。27三、卡那霉素残留检测卡那霉素检测试剂盒28•2015年版药典凡例十六：（3）生产过程中，应尽可能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险相对较低抗生素，使用抗生素种类不得超过1种，且产品后继工艺应保证可有效去除制品中抗生素，去除工艺应该验证。•（4）生产过程中使用抗生素时，成品鉴定中应检测抗生素残留量，并规定残留量限制。上述的生产过程包括种子培养活化，发酵，纯化等所有的步骤，所以种子活化阶段是算在生产过程中的。29试验原理•采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素的含量。30操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。315、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml到对应的微孔中，加入酶标二抗50ml/孔，再加入抗体工作液80ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。7、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中避光反应15min。8、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。32定量分析•（1）百分吸光率的计算标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝B/B0×100%B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值•（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以卡那霉素标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中卡那霉素实际残留量。33卡那霉素测定方法验证•检测方法和标准曲线竞争ELISA法测定药盒卡那霉素标准品34卡那霉素在样品溶液中的回收率试验浓度(ppb)回收率(%)Mean(%)CV(%)20.097.5595.1198.7199.15101.8497.6998.342.255.095.7982.9088.29103.6498.7288.4292.968.311.088.5289.6789.4189.4192.4086.1489.262.26卡那霉素在样品稀释液中的回收率(n=6)35精密度试验试验浓度（ppb）20.05.01.0实测值准确度(%)实测值准确度(%)实测值准确度(%)板内Ⅰ25.55102.204.9298.350.9999.2124.8599.415.12102.381.07107.0725.76103.064.9398.620.8989.4225.37101.504.6192.280