Gal4-has-果蝇杂交系统指南

第27卷第5期2015年5月Vol.27,No.5May,2015生命科学ChineseBulletinofLifeSciences文章编号：1004-0374(2015)05-0631-09DOI:10.13376/j.cbls/2015085∙技术与应用∙收稿日期：2015-01-23；修回日期：2015-02-17基金项目：浙江省科技计划项目(2013C37001)*通信作者：E-mail:[e-mail]；Tel:[phone]黑腹果蝇二元表达系统原理及应用陈轮号1，刘怿君2*(1浙江大学医学院临床医学系，杭州310058；2浙江大学医学院神经生物学系，杭州310058)摘　要：二元表达系统是简单、高效的遗传操作工具，提高了特定基因的重组效率，实现了基因精确时空表达。目前应用于黑腹果蝇的二元表达系统主要有GAL4/UAS、FLP/FRT、LexA/lexAop、Q系统以及Cre/loxP、CRISPR/Cas9系统，其中GAL4/UAS和FLP/FRT系统应用最为广泛。二元表达系统的联合成功应用于嵌合体的构建，为细胞谱系分析、细胞间相互作用等研究提供了强有力的工具。综述了果蝇二元表达系统的原理、应用及各系统之间的联合应用，为研究者选择遗传操作工具提供了参考。关键词：黑腹果蝇；基因表达；遗传技术中图分类号：Q-31；Q786；S436.631.29文献标志码：ATheprincipleandapplicationsofbinaryexpressionsystemsinDrosophilamelanogasterCHENLun-Hao1,LIUYi-Jun2*(1DepartmentofClinical,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China;2DepartmentofNeurobiology,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)Abstract:Binaryexpressionsystemsaresimpleandidealgenetictechniques,whichhaveincreasedefficiencyofgenerecombinationandallowedtheprecisemanipulationofgeneexpressioninatemporalandspatialfashion.BinaryexpressionsystemswidelyusedinDrosophilamelanogasteratpresentincludeGAL4/UAS,FLP/FRT,LexA/lexAop,Qsystem,Cre/loxP,andCRISPR/Cas9system,andamongthem,GAL4/UASsystemandFLP/FRTsystemaremostwidelyused.Thecombinationofthesesystemshassucceededinestablishingmosaic,providingpowerfultechniquesforstudiesincelllineageanalysis,interactionamongcellsandsoon.ThisreviewsummarizestheprincipleandapplicationsofbinaryexpressionsystemsinDrosophilamelanogasterandfurtherintroducestheco-applicationsamongthesesystems.Ourintentionistoprovideguidanceandsuggestionsregardingwhichgenetictoolsaremostsuitableforresearchers.Keywords:Drosophilamelanogaster;geneexpression;genetictechniques黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)，因伴性遗传为人们所熟知，又因二元表达系统的应用而成为科研界的宠儿。实验研究中，研究者可以通过精确的遗传操作标记组织或细胞，提高实验的特异性，达到在组织或细胞中精确调控某一基因等目的。目前，实现精确遗传操作的重要工具之一是二元表达系统。二元表达系统通常由调控基因表达的两个部件构成：(1)组织特异性的转录激活因子；(2)受上游激活序列控制的目的基因。当组织特异性转录激活因子与上游激活序列结合后，目的基因出现表达。应用于果蝇的二元表达系统主要有GAL4/UAS、FLP/FRT[1]、LexA/lexAop[2]、CRISPR/Cas9系统[3-4]、Q系统[5-6]及Cre/loxP[7]系统，其中GAL4/UAS、FLP/FRT系统应用最为广泛，也是多重二元表达系统联合应用的基石。二元表达系统的单独及联合应用大生命科学第27卷632大提高了基因表达的时空特异性、遗传操作的效率以及实验的可重复性，使得果蝇这一模式动物更加广泛地应用于科学研究的各个领域。1　果蝇二元表达系统简介1.1　GAL4/UAS系统半乳糖调节上游启动子元件(galactose-regulatedupstreampromoterelement,GAL4)是在酵母中发现的转录激活因子，可以与DNA序列中的特殊位点半乳糖上游激活序列(galactoseupstreamactivatingsequence,UASG或UAS)结合，诱导UAS下游基因的转录与翻译。利用分别带有GAL4和UAS的转基因果蝇品系进行杂交，产生的后代可以条件性表达UAS序列所连接的目的基因(图1A)。值得注意的是，利用不同特性的GAL4可以实现基因在不同的时间和空间特异性表达。为了精确控制果蝇中GAL4/UAS系统表达，目前有3种常用方法：(1)利用GAL4的抑制因子GAL80去调节GAL4的活性[8]；(2)利用物理的方法，如将热休克蛋白启动子与GAL4基因相连后通过热激诱导GAL4蛋白表达[9]；(3)利用化学方法，如四环素应答系统，调控GAL4/UAS系统的表达[10]。1.2　FLP/FRT系统FLP/FRT系统首先于酵母体内发现，是一种位点特异性重组系统。FLP重组酶(flippaserecombinationenzyme)具有位点特异性，FRT是FLP重组酶的特异性结合位点。FLP重组酶可根据两段FRT序列的方向及位置差异而产生不同的基因重组结果(图1B)：(1)当两段FRT序列方向一致并在同一条DNA上，FLP可以介导删除FRT序列之间的DNA片段和一个FRT序列，并使被删除的序列成环而丧失转录活性；(2)若FRT序列位于同一条DNA上但方向相反，则FLP会介导FRT序列之间的倒位；(3)若FRT序列位于两条DNA序列上，则FLP介导侧翼序列(flankingsequence)之间的易位。FLP/FRT系统常应用于基因的定点敲除及嵌合体的构建(图1C)。1.3　LexA/lexAop系统Lai和Lee[2]建立了独立于GAL4/UAS系统之外的LexA/lexAop系统。该系统的原理与GAL4/UAS系统类似，能够诱导基因的时空表达，但是这两个系统之间互不干扰，因而有潜力成为另一广泛应用的二元表达系统。lexAoperator，简称lexAop，是受LexA蛋白调控的操纵基因，当LexA与lexAop结合后，可以激活lexAop下游基因的转录。VP16是疱疹病毒的一个转录激活因子，LexA和VP16分别与lexAop和目的基因活化序列结合后，激活目的基因的转录。由于该过程不能被GAL80所抑制，因此又叫作非GAL80抑制的LexA/lexAop系统(图1D左)。相类似的，LexA和GAL4激活结构域(GAL4activationdomain,GAD)与lexAop及后续序列结合，同样可以激活目的基因转录。但是当该系统内引入GAL80后，由于GAL80结合GAD可以抑制lexAop下游基因的转录，因此又叫作GAL80抑制的LexA/lexAop系统(图1D右)。1.4　Q系统Potter等[5-6]利用脉孢菌(Neurospora)的qa基因簇设计了一种新的二元表达系统——Q系统。Q系统与LexA/lexAop系统的原理类似，与GAL4/UAS系统互不干扰。该系统由3大原件组成：转录激活因子qa-1f(QF)、效应元件QUAS以及QF的抑制子qa-1s(QS)。在Q系统中，QUAS为一段5个拷贝(每个拷贝长度16bp)的序列，与下游的目的基因相连。QF为转录激活因子，当其表达后与QUAS结合，激活目的基因的表达；QS为QF的抑制子，当QS表达时，抑制QF与QUAS结合(图1E)；奎尼酸(quinicacid)可以解除QS的抑制作用，该抑制作用具有剂量依赖性。Q系统与GAL4/UAS系统相比，能够更加精确地标记一个或一小群细胞[5]；但是，Q系统的限制是特异性表达的QF品系少，且构建果蝇品系需要转入的基因多，操作复杂，因而该系统的应用范围相较GAL4/UAS系统更为有限，目前主要应用于以线虫和果蝇为模式动物的研究。1.5　Cre/loxP系统Cre/loxP系统首先发现于P1噬菌体中[11-13]，被广泛应用于哺乳动物的基因操作。该二元表达系统中，Cre重组酶(causesrecombinationenzyme)相对分子质量为3.8×104，可以特异性识别34bp的loxP(locusofX-overP1)序列，直接介导loxP位点之间的基因重组。Cre介导的loxP位点之间的基因重组具有方向性。当两个loxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre能有效切除两个loxP位点间的序列；两个loxP位点方向相反，Cre则导致两个loxP位点之间的序列倒位。当两个loxP位点分别位于两条不同的DNA链上，Cre介导两链之间的基因交换。虽然Cre/loxP系统的原理与FLP/FRT系统类陈轮号，等：黑腹果蝇二元表达系统原理及应用第5期633A：GAL4/UAS系统。GAL4基因在启动子的存在下出现表达，表达产物与UAS基因结合从而诱导UAS下游的基因X的表达。B：FLP/FRT系统。FLP介导同一DNA链上方向一致的FRT序列之间的基因删除，方向相反的FRT序列之间的基因倒位，同源染色体FRT位点之间的基因交换。C：FLP/FRT系统构建嵌合体。FLP介导了同源染色体FRT(箭头)位点之间的有丝分裂重生命科学第27卷634似，但两者的应用存在许多差异：FLP受热更易分解，30℃为其最适温度，当温度超过39℃时则基本检测不到活性，而Cre的最适温度为37℃或更高。因此，Cre/loxP系统更适用于哺乳动物，而FLP/FRT系统则适用于培养细胞以及果蝇等变温动物的基因改造[11]。尽管早在1996年，Siegal和Hartl[7]已将Cre/loxP系统应用于果蝇，并成功删除了白眼基因，但是该系统在以果蝇为模式动物的研究中应用非常有限。2　不同二元表达系统的优缺点对比虽然上述5种二元表达系统为细胞增殖、分化及个体发育过程提供了有利的研究工具，但是每种二元表达系统均具有一定的局限性，如组织表达不够特异、热激改变生理特性等。表1总结了上述5种方法的优缺点，以便于研究者根据实际情况进行选择。3　二元表达系统之间的联合应用3.1　GAL4/UAS和FLP/FRT系统的联合应用Duffy等[14]研究发现，FLP/FRT具有特定位点重组的优点。过去的研究者运用热休克蛋白、紫外线(UV)等方法激活FLP/FRT系统，但是这些物理方法缺点是致死率高，无法控制表达特异性，并且成功率低[14]。后来，Duffy等[14]利用GAL4/UAS系统调控特异性表达，与FLP/FRT系统联合应用，发展了“定向嵌合体(directedmosaic)”技术(图