药物的安全性评价试验方法

全身用药的毒理研究第一节新药急性毒性试验急性毒性：24h内单次或多次大剂量给予某种药物所出现的有害作用。急性毒性试验毒性反应类型定性出现和消失时间可能的靶器官和死亡原因致死量定量最大给药量半数致死量急性毒性试验的目的和意义：1、测定药物的半数致死量及相关参数2、通过观察药物急性中毒症状，推测药物的毒性靶器官3、为长期毒性试验和特殊毒性试验提供剂量设计参考二、试验内容（一）半数致死量（LD50）试验目的：观察一次给予受试药物后动物产生的毒性反应和死亡情况，计算LD50。试验方法：1、动物：小鼠或大鼠2、动物分组：随机原则3、剂量设计：5~6个剂量组（LD0~LD100）4、给药途径：两种5、观察时间：14天左右•6、观察指标：中毒症状、LD50中毒症状：被毛，行为学变化，情绪，神经症状（震颤、痉挛、抽搐、步态不稳等），呼吸频率，肛门周围有无污染，眼、鼻、口有无分泌物，体温，体重变化等剖检检查：各脏器的变化等。组织切片急毒试验常见观察指针及可能涉及的组织、器官、系统LD50测定的缺陷：•1、动物消耗量大，获得的信息有限•2、影响因素较多，数据重复性较差•3、从安全性评价角度来看，需要的不是精确的LD50值，而是更多的毒性信息（二）最大给药量试验在受试药物合理的最大容积和最高浓度条件下，单次或24h内多次给予试验动物不产生死亡的最大给药量试验。常用于某些低毒的药物急性毒性试验。（三）最大耐受量试验•单次给药引起动物出现明显的中毒反应而未发生死亡的剂量。•多用于毒性较小的药物研究试验方法：1、动物：小鼠、大鼠、犬等2、动物数：小动物10~20只；大动物4~6只（雌雄各半）3、给药途径：临床给药途径4、试验对照：5、观察时间：7~14天大体解剖如有改变——组织切片6、结果与评价：描述动物单次大剂量给药或在24h内接受多次大剂量给药后，在短期内出现的与药物相关的毒性反应，发生、发展过程提供不引起动物死亡的最大剂量。（四）固定剂量试验不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为重点进行药物的急性毒性评价。试验方法：选5、50、500、2000mg/kg四个固定剂量进行试验动物：大鼠预试：500mg/kg正式试验：根据预试结果，从四个固定剂量中选择一个可能产生明显毒性，但不引起死亡的剂量进行试验。观察指标：同半数致死量试验。固定剂量法试验结果的评价剂量（mg/kg）试验结果存活数100%100%存活，毒性表现明显100%存活，无明显毒性反应5高毒（LD50mg/kg）有毒（LD50：25~50mg/kg）用50mg/kg试验50有毒或高毒，用5mg/kg试验有害（LD50：200~2000mg/kg）用500mg/kg试验500有毒或有害，用50mg/kg试验LD502000mg/kg用2000mg/kg试验2000用500mg/kg试验该药物无严重急性中毒的危险性（五）近似致死剂量试验1、估计可能的毒性范围2、按50%递增法，设计出含10~20个剂量组3、测出最低致死剂量和最高非致死剂量后，用二者之间的剂量（即近似致死剂量）给一只动物三、LD50计算方法•Bliss法•加权概率单位法•寇氏法•改良寇氏法LD50=㏒-1[Xm–i(∑P–0.5)]Xm：最大剂量的对数值i：相邻两组剂量对数值之差P：各组动物死亡率，用小数表示（如死亡率为80％应写成0.80）∑P：各组动物死亡率之总和第二节新药长期毒性试验•长期毒性：试验动物连续多次接触较大剂量的药物所引起的中毒效应。•长期毒性试验：为观察药物的长期毒性而设计的毒理学试验。又被称为重复给药毒性试验。长期毒性试验的目的1、反复多次给药的情况下，实验动物出现的毒性反应、量效关系、主要的靶器官、损害程度及其可逆性。2、获得反复给药情况下，实验动物能耐收的剂量范围及完全无毒性反应的安全范围。一、一般原则1、试验动物：二种（啮齿类和非啮齿类）动物数量、性别、年龄、敏感性2、给药期限：一般为临床疗程的3~4倍时间创新药品试验周期不少于90天3、剂量选择：高中低三个组高剂量组：能充分反映药物的毒性，但不能造成太多动物死亡。低剂量组：无毒。4、给药方法：最好与临床给药途径一致5、观察途径：日常观察（生长率、食耗、一般观察等）测定指标：器官重量、血液学变化、血液生化学指标二、检测项目1、日常观察：一般指标：被毛、皮肤、眼睛、呼吸、行为活动、病理检查等。生长率食耗2、测定指标血液学指标（红细胞、网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞总数级分类、血小板等）血液生化指标（天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨酸氨基转换酶、碱性磷酸酶、尿酸氮、总蛋白、白蛋白、血糖、总胆红素、肌酐、总胆固醇）器官重量三、检测指标的时间（一）检查间隔一般症状：每天观察记录测定指标：定期检查（二）恢复期观察最后一次给受试药物后，部分动物进行活杀检测各项指标，留下约1/3~1/4动物进行恢复期观察。恢复期观察目的：了解毒性反应的可逆性和可能出现的延迟性毒性。四、结果评价1、试验结果数据应进行统计学处理2、根据实验目的，结合观察到的毒性表现作出恰当的评价3、通过实验结果确定毒性靶器官和毒性表现4、可结合其他试验同时观察第三节制剂的全身毒性试验一、静脉注射制剂的全身毒性试验1、血管刺激性试验目的：观察受试静脉注射制剂经多次给药后对血管刺激反应情况。试验方法：动物：家兔分组：试验组、空白对照组给药方法：多次静脉注射观察指标：肉眼观察病理切片2、体外溶血试验目的：观察静脉注射剂是否能引起溶血现象。试验方法：（1）制备2%红细胞悬液（2）加样（3）保温（4）结果观察全溶血：溶液澄明，红色，管底无红细胞残留部分溶血：溶液澄明，红色或棕色，管底有少量红细胞残留不溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色透明。镜检红细胞不凝集。3、过敏性试验（致敏试验）•目的：观察受试药物经注射给药后有无过敏反应。试验方法：动物：豚鼠分组：3组（给药组、空白对照组、阳性致敏组）给药方法：腹腔注射结果观察：过敏性反应（痉挛、呼吸困难、皮疹等）•热源：微生物产生的能引起人及恒温动物体温异常升高的物质，主要是革兰氏阴性菌细胞壁分离出来的内毒素。4、热原试验目的：将受试药静脉注射给予家兔，观察家兔体温升高情况，以判定药物是否具有致热作用。试验方法：•动物：家兔•给药方法：耳缘静脉注射•观察指标：体温一般药理学评价•评价新药在拟推荐临床使用剂量下对重要的生命活动（如心血管系统功能、中枢神经系统功能、呼吸系统功能、胃肠道功能、内分泌功能、外周神经功能、尤其是体液传递机制及其神经冲动和骨骼肌功能等）的影响的研究，以预期用于临床防治疾病主要目的以外的其它广泛的药理作用，从而达到基本认识全身用药对机体主要器官系统影响的目的。一般药理学评价的基本要求1、精神神经系统•常用动物：小鼠•观察指标：行为学变化、对神经系统的兴奋或抑制作用。2、心血管系统•常用动物：大鼠、犬、猫等•观察指标：血压、心率、心电、血流动力学变化等3、呼吸系统•常用动物：犬、猫等大动物•观察指标：呼吸频率、呼吸深度、呼吸类型等。局部用药的毒性试验是根据局部用药部位的解剖和生理特点设计的。涂剂、擦剂皮肤用药膏剂、凝胶剂其他透皮吸收制剂常用局部用药制剂滴眼剂、滴鼻剂喷雾剂、肌内注射直肠和阴道制剂第十九章局部用药的毒性研究第一节皮肤用药的毒性试验一、皮肤的组织结构皮肤由表皮、真皮及皮下组织等构成皮肤覆盖全身。表皮较薄，厚为0.1-0.2mm。角质层表皮颗粒层生发层真皮依附于皮下组织，厚约2mm。胶原真皮弹性硬蛋白纤维母细胞二、化学物质对皮肤毒性作用的类型（一）皮肤原发性刺激指药物直接作用于皮肤引起的病理学反应。原发性刺激的表现：红斑、水肿、水疱疹、溃疡、荨麻疹等作用机理：1、直接刺激作用2、使皮肤表面蛋白质变性药物：强酸、强碱、强氧化剂、重金属等（二）皮肤致敏•作用机理：变态反应•药物：抗生素、非甾体类抗炎药、局麻药、消毒药等（三）皮肤致癌三、皮肤用药毒性试验（一）急性毒性试验1、试验目的：观察动物完整皮肤及破损皮肤短期内接触受试药物所产生的毒性反应。2、试验材料（1）动物：成年健康家兔、豚鼠、大鼠（2）药物制剂：膏剂、液体制剂、粉末3、试验方法（1）剂量：3个剂量组（2）给药途径：将药物均匀涂布于动物背部皮肤（经脱毛处理）（3）观察指标：全身反应、死亡情况、各系统变化、剖检变化（二）皮肤用药长期毒性试验1、试验目的：观察动物皮肤长期接触受试药物，经皮肤渗透或吸收后对机体产生的异常反应及其可逆程度。2、试验材料•（1）动物：成年健康家兔、豚鼠、小鼠•（2）受试药物：膏剂、液体制剂、粉末3、试验方法（1）剂量：3个剂量组（2）给药途径：将药物均匀涂布于动物背部脱毛区，每日一次，每次至少接触6小时（3）观察指标：全身反应第二节眼睛用药刺激性试验1、试验目的：观察动物眼睛接触受试药物产生的刺激反应情况。2、试验材料•（1）动物：成年健康家兔•（2）受试药物：原液或原3、试验方法（1）试验分组：1个剂量组，1个对照组（2）给药方案：将药物滴入或涂敷于动物一侧眼结膜囊内，另一侧作为对照。（3）观察指标：6、24、48、72h、7d观察眼部反应情况（具体观察评分方式见书177页）第三节肌肉注射用药局部刺激性试验•试验目的：观察药物肌内注射后是否具有局部刺激作用•试验方法（略）第四节滴鼻剂和吸入剂急性毒性试验1、试验目的：观察受试药物一次滴入或吸入后对动物产生的毒性反应或死亡情况。2、试验材料：（1）动物：大鼠、豚鼠或家兔（2）药物：液体或粉末制剂3、试验方法：（1）试验分组：3个剂量组（2）给药途径：滴入或吸入（3）观察指标：全身状况、体重、呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等变化。滴鼻剂和吸入剂刺激试验1、试验目的：观察药物一次或多次滴入或吸入后动物产生的刺激反应。2、试验材料（1）动物：大鼠、豚鼠或家兔（2）药物：液体或粉末制剂3、试验方法（1）试验分组：3个剂量组（2）给药途径：滴入或喷雾给予动物，接触至少4h（3）观察指标：粘膜的充血、出血程度、病理学变化第五节肠道制剂的毒性试验急性毒性试验•试验目的：观察动物直肠一次接触受试药物后产生的毒性反应或死亡情况。•试验材料•试验方法长期毒性试验•试验目的：观察动物直肠或阴道反复多次接触受试药物后产生的毒性反应或死亡情况。•试验材料•试验方法局部刺激试验•试验目的：观察动物直肠一次或多次接触受试药物后产生的刺激反应情况。