基因的概念重组测验互补测验

目录第七章基因精细结构遗传分析第一节基因概念第二节重组测验第三节互补测验第四节缺失作图第五节断裂基因与重叠基因第五节基因功能目录教学内容要点基因的概念、重组测验、互补测验、断裂基因与重叠基因、基因的功能目录难点重组测验、互补测验与基因的功能目录7.1基因概念和精细结构7.1.1基因概念的发展(1)遗传因子(孟德尔）(2)染色体是基因载体（摩尔根）(3)DNA是遗传物质（肺炎双球菌的转化实验）(4)基因是有功能的DNA片段（G.Beadle和E.Tatum:一基因一酶）(5)操纵子模型(Jacob和Monod)(6)跳跃基因和断裂基因的发现目录表7-1眼成虫盘移植实验供体受体移植眼的颜色（1）+ν鲜红（2）ν+鲜红（3）+cn鲜红（4）cn+鲜红（5）cnν橙红（6）νcn鲜红+鲜红的（brightred），v:桔黄色眼（vermilion），cn橙红色眼（cimnabar），和暗红色眼（scarlet）。目录7.1.2基因的类别和相互关系(1)结构基因(2)rRNA和tRNA基因(3)启动子和操纵基因目录7.1.2基因的类别及其相互关系根据基因的功能和性质，分为:(一)结构基因（structuralgenes）与调节基因（regulatorygenes）(二)核糖体RNA基因（ribosomalRNAgenes，简称rDNA）与转移RNA基因（transferRNAgenes，简称tDNA）(三)启动子（promotor）与操纵基因（operator）前者是转录时RNA聚合酶与DNA结合的部位；后者是调节基因产物阻遏蛋白或激活蛋白与DNA结合的部位，目录7.1.3基因与DNA多数肽链由150～300个氨基酸组成，按三联密码子，须有450～900个核苷酸对编码，加上基因内不编码的核苷酸序列，一个基因约有500～6000个核苷酸对。并非DNA分子上任一含有几千个核苷酸对的区段都是一个基因，基因是一个含有特定遗传信息的DNA分子区段。特定核苷酸序列与其转录产物RNA核苷酸序列或翻译产物多肽链氨基酸序列相对应就是基因,要同时测定某一段DNA的核苷酸序列和相应产物的序列。目录7.2重组测验7.2.1拟等位基因黑腹果蝇红眼由一个显性基因控制，位于X染色体上，果蝇眼睛还有许多其他颜色，如粉红色、杏色、伊红、象牙色和白色等突变型。早期研究认为控制这些眼睛颜色性状的基因是等位的，之间是复等位关系。用“＋”代表野生型红色眼基因，wa代表杏色眼基因，w代表白色眼基因，当杏色眼（wa／wa）与白眼（w／Y）果蝇杂交时，F1为杏色眼，如果wa与w是等位基因，F１应只有两种亲本表型，但在大量F1群体中约有1／1000野生型红眼果蝇。红眼的出现不是突变，因为突变没有如此高频率。目录进一步研究证明杏色眼基因和白眼基因虽然在染色体上所占位置相同，即位于同一基因，但属于不同位点，之间可发生交换。如杏色眼wa++/wa+x白眼w/Y，F1杏色眼。wa+/+w和wa+/Y，F1雌蝇减数分裂时发生交换形成++与waw配子，++配子与任何其他配子结合所形成的F1个体均表现为野生型红眼果蝇，因而F1群体中出现野生型个体。目录对杏色眼wa+/+w与野生型++/waw两种个体进行比较发现,基因组成一样，但排列不同，前者两个突变分别在两条染色体上，为反式（trans）排列，后者则是两个突变同时排在一条染色体上，而另一条染色体上两个位点均正常，为顺式（cis）排列。目录反式排列表现为突变型，顺式排列为野生型。这种由于排列方式不同而表型不同的现象称为顺反位置效应（cis-transpositioneffects），并将这种紧密连锁的功能性等位基因，但不是结构性的等位基因称为拟等位基因（pseudoallele）。拟等位基因的发现证明了基因的可分性。目录7.2.2噬菌体突变型S．Benzer对大肠杆菌噬菌体T4的rIIA和rIIB两个基因的结构分析，证明了基因的可分性，基因内有大量的突变子和重组子。噬菌体的突变型可归为：①噬菌斑形态突变型：一些是由于侵染寄主后溶菌速度的快慢而形成大小不同的噬菌斑（plaque）；另一些是由于被感染细菌是全部或是部分被杀死而形成清晰或混浊的噬菌斑。目录②寄主范围突变型：噬菌体感染细菌时，首先吸附于细胞表面专一受体上，由受体基因控制，如果受体发生改变，可能使噬菌体不能附着，从而该噬菌体的寄主范围缩小。另外噬菌体突变也可扩大寄生范围。因为决定噬菌斑形态和宿主范围突变的基因在其基因组中相当狭窄的特定区段里，大多数基因涉及生命过程必不可少的功能，所以上述突变通常是致死的。目录③条件致死突变型：条件致死突变型在遗传学研究中具重要意义，通过这种突变已鉴定出噬菌体的大部分基因。Benzer所用T4的rII突变就是遗传学研究中所用的第一个条件致死突变型。目录T4噬菌体有多个迅速裂解突变型，分别称为rl，rII，rIII等，它们位于染色体DNA的不同区段，这3组突变型由于在大肠杆菌不同菌株上的反应不同可以相互区别。T4rII突变使所侵染细胞迅速裂解形成大噬菌斑，所以称为rII突变型。目录Benzer对rII区域的突变进行了分析：rII突变感染大肠杆菌B菌株后迅速裂解，形成比野生型大的噬菌斑，从而从大量的rll+中筛选出rll。另外rll突变型感染带有原噬菌体的大肠杆菌K（λ）菌株时，不产生子代，而野生型T4rII在大肠杆菌K（λ）菌株中能正常增殖，由此也很容易在rll噬菌体中检出rll+噬菌体，所以可检出两种不同的rll突变型之间重组频率极低的重组子。目录Benzer的噬菌体重组实验DiscoveryofRecombinationWithintheGeneBenzer以T4噬菌体为材料进行了研究工作，正式提出“顺反子”这个术语rIIAmutantrIIBmutant单独感染E.coliK单独感染E.coliK混合感染E.coliK能正常生长不能正常生长不能正常生长目录Benzer顺反子概念和基因内重组DiscoveryofRecombinationWithintheGenem1rIIAChromosomecarringmutation1m2rIIAChromosomecarringmutation2RecombinationwithinthegeneChromosomecarringmutation1and2WildtypeBenzer将两个rIIA突变型对B株进行混合感染，再让释放的子代噬菌体感染K株。出现了野生型噬菌体。目录r47r47r47++r104精细作图r47++r106r47++r102B菌株K菌株目录7.3互补测验7.3.1互补测验原理和方法基础遗传学研究首先须有突变型，然后分析突变型间的关系。重组测验与互补测验是确定这种关系的两个基本方法。重组测验以遗传图距确定突变的空间关系，而互补测验则是确定突变的功能关系。目录如rII区有3000多个突变型都有相同表型，这是由于所有的rII突变都导致丧失合成E.coliK(λ)发育所需要一种或几种蛋白质能力，这些突变型对E.coliK(λ)寄主细胞致死，但可在E.coliB菌株细胞中增殖。既然它们有相同表型，是否它们都影响同一种遗传功能？rII中这3000多个突变型是属于一个基因还是属于几个基因？为划分这种功能单位界线，要进行互补测验。目录用不同rll突变型成对组合同时感染大肠杆菌K(λ)菌株：如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体（也有少量重组型的噬菌体），那么必然是一个突变型补偿了另一个突变型所不具有的功能，两个突变型称彼此互补（complementation）。如果双重感染的细菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变型一定有一个相同功能受到损伤。目录互补测验斑点测试法（spottest）用一种rII突变型以0.1感染比（噬菌体1/细菌10）感染E.coliK(λ)菌株。噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在平板，琼脂凝固后在平板上划出的一定位置上再加一滴含另一种rII突变型的培养基。在这一滴培养基范围内，一些细菌会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬菌斑，证明这两种突变型互补，相反不能互补。在一个培养皿平板上可做6～8个斑点试验。目录该方法测定重组频率极敏感，重组检出率达1/106，理论上可测得0.002%的重组值，实际上所观察的最小重组频率为0.02%。根据二点杂交的结果，可作成连锁图。目录互补测验结果发现，除一些缺失突变型外，rII突变型可分成rIIA和rIIB两个互补群。rllA突变型的突变位点都在rll区的一头，是一个独立的功能单位；所有rllB突变型的突变位点都在rll区的另一头，也是一个独立功能单位。凡属rIIA的突变之间不能互补；同理属于rllB的突变之间也不能互补，只有rIIA的突变和rllB的突变间可互补，双重感染E.coliK(λ)菌株后可产生子代。说明r11A和r11B是两个独立的功能单位，分别具不同的功能，但它们又是功能互补的，要在E.coliK(λ)菌株中增殖，两种功能缺一不可。可见rII是由于这两种遗传功能丧失而成的。目录r106r51++r106++r51顺反测验r47106++r47++r106K菌株B菌株目录目录顺式测验反式测验突变位点在同一顺反子内AB+－AB突变位点在不同的顺反子内+AB+AB图5-20顺反测验结果的图解。当顺式有功能，而反式没有功能时，突变位点突变位点在同一顺反子内；当顺式有功能，而反式也有功能时，突变位点突变位点在不同顺反子内。目录目录Benzer将不同突变间没有互补的功能区称为顺顺反子（cistron）。一个顺反子就是一个功能水平上的基因，因此常用顺反子作为基因的同义词。目录如rII区里rIIA是一个顺反子，rIIB另一个顺反子。每个顺反子在染色体上的区域称为基因座，而每个基因座中有若干个突变位点，是顺反子内部能发生突变的最小单位。DNA中每一核苷酸对改变都可引起多肽链中氨基酸改变，从而影响顺反子功能。它们本身没有独立的功能，在它们之间可以重组。由此可见顺反子既具有功能上的完整性，又具有结构上的可分割性。目录7.3.3基因内互补互补测验中已知同一顺反子内两突变不能互补，但有例外:发生于同一基因内两个不同位点突变致使两条原来相同的多肽转变成两条分别在不同位点上发生变异的多肽链，而后将这两条多肽构成双重杂合子，两者配合起来，可表现程度不同的恢复酶活性部位，称为基因内互补（intrageniccomplementation）。目录基因内互补对互补测验存在一定干扰，通过研究发现，基因内互补与基因间互补可区分开：①基因间互补普遍存在，而同一基因内不同位点突变绝大多数不能互补，只有少数例外。②基因内两个突变能互补的只能是点突变，无缺失，突变一定是错义突变，不是无义突变或移码突变；③基因内互补作用的酶活性明显低于正常水平，最多只有野生型酶活性的25％，形成的蛋白质常有某种异常，如温度的稳定性或pH依赖性等。目录7.4缺失作图7.4.1缺失作图原理Benzer研究rII突变型时发现一些突变由于核苷酸对发生改变，称点突变(pointmutation)。而另一些突变由于缺失相邻的许多核苷酸对，称缺失突变(deletionmutation)。尽管两种突变形成相同表型效应，但有区别：①点突变是单个位点突变，缺失突变是多个位点突变（multisitemutation）；②点突变可发生回复突变，而缺失突变不可逆；③点突变与其他点突变间可发生重组，而缺失突变同另一个点突变间不能重组，因为相应片段已缺失。这个杂交中没有一个基因组在这个点突变位置上正确的核苷酸对，无法通过重组而恢复野生型核苷酸顺序。目录7.4.2缺失作图方法0.5mlE.coliB菌株培养物加1滴缺失型噬菌体和1滴待测rII突变噬菌体，几分钟后取一滴菌液加在灭菌纸条上，铺在长有E.coliK(A)菌株平板上，经培养如在纸条覆盖区域内形成清晰噬菌斑，说明它们之间发生重组，产生野生型噬菌体，阴性结果就说明子代中重组体非常低，空白对照出现几个噬菌斑是点突变回复突变产生的