大鼠灌注固定取脑,解剖取材

大鼠灌注固定取脑主讲：陈爽2017.9.12用途1.用于常规HE染色，免疫组化分析。2.冰冻切片可以不做脑组织固定。3.不可用于westernblot和PCR。4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。原理心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体，准确检测其表达的位置和量。必要性1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响流程麻醉开胸心尖向左心室穿针剪开右心耳生理盐水冲洗4%多基甲醛固定取脑保存或切片.具体过程大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定,切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。•1.多聚甲醛的配置：•一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40gPFA溶于装•有500mlDEPC水的玻璃容器烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅•拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，•使呈清亮状（滴加），再加入约500mlPBS，充分混匀（在冰浴•或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温•或4℃保存备用。•简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱•密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时•震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。•也可用10%福尔马林溶液，甲醛1：10稀释甲醛100ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠6.5g蒸馏水900ml或甲醛100ml加900mlPBS缓冲液。•2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。•3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。•4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用止血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯•剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断•膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，•直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。•5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液•体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的•有效观察指标。•6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。•7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间2h，•过夜最好省时省剂的方法夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白即可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬大鼠脑组织取材步骤1.剪开皮肤•2.用钩镊再眼眶处固定大鼠颅骨，用组织剪再颅骨和颈椎连接处剪断•3.组织剪头部伸入枕骨大孔，尽量贴着骨头（不能插太深伤到脑组织）。•4.组织剪从枕骨大孔处伸入，朝向同侧眼眶方向，贴着骨头剪，剪到眼眶5.从大鼠眼眶之间剪断6.左手持钩镊插入大鼠的眼眶固定颅骨，用弯钳直接夹住枕骨大孔处的骨头直接就掀起来了从小脑处将脑组织向上推起，用小剪刀剪断脑神经注意事项•1.多聚甲醛气味刺激，配置时做好自我保护。•2.暴露心脏这一步骤，容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸”，人工气胸后，肺萎缩，胸腔里的空间增大，提拉剑突后，不容易损伤肺、心及肝脏，出血少。•3.经心脏灌注，有时穿刺针会误进右心室，那样灌注主要在肺循环起作用，体循环的血液影响不大。所以观察将穿刺针插入到主动脉内可以确保起到体循环灌注冲洗血液的效果，脑组织的血液冲干净后，才不会影响免疫组化的效果，不然到处都是红细胞造成的背景染色。•4.灌注时注意排空输液管中的气泡，不然容易气栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。•5.关于生理盐水的温度的选择，有人认为因为是快速冲刷血管里的血液，低温造成血管收缩，灌注的效果反而没有室温的好。但是用低温的认为，低温有利于组织完整。•6.灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。•7.去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉。常见问题1.灌注取脑不可用于Westernblot及PCR的原因•多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体，准确检测其表达的位置和量。•Western中，要用去污剂使各种蛋白发生变性、解聚，并变成统一的线性肽链，从而能够用凝胶电泳进行分子量的梯度分离。多聚甲醛会影响蛋白的解聚，从而使其无法用凝胶分离。另外，WB和免疫组化所使用抗体的抗原表位也不同，WB的抗体一般识别蛋白的一级结构，所以可能也无法识别甲醛处理的蛋白。•PCR要提RNA，RNA非常容易降解，必须新鲜取组织，然后尽快超低温冷藏或者马上抽提，否则非常容易降解。灌注固定的组织，原则上是能够提得出DNA和RNA的，但是肯定会有较多的降解，一般不会这样做。2.没有灌注固定的大鼠脑组织,能不能做切片和免疫组化？•如果没有灌注固定，而是直接取材然后放入固定液中，可以进行免疫组化染色，只是效果不如灌注固定的好•尤其是要做电镜时更明显。有的标记蛋白要求较高，固定不好就难以染好。3.用4%多聚甲醛固定但保存了2周才做石蜡切片，对免疫组化有无影响？固定时间过长蛋白多肽链都交连在一起了,抗原性就很弱了，很可能没有阳性结果,抗原修复时一般的修复很难把抗原性恢复.可能会有影响，但不会太大。固定时间长，抗原修复时间也要长一些。4.灌注多长时间？灌注液多少？•每个人的灌注液用量都不一样，灌注速度也能没有很清楚的说法，灌注时间也不确定。主要还是看灌注成功的标志。现将看到的比较详细的处理方法列出。灌注速度，大家比较公认的是先快后慢。•短期灌注：采用心脏穿刺快速灌注20min,其中生理盐水灌注50~100mL,4%多聚甲醛缓冲液灌注150mL。•长期灌注：灌注时间延长到1h,其中生理盐水灌注200mL,4%多聚甲醛缓冲液灌注400mL。•短期灌注组脑组织结构保留基本良好,与长期灌注组相比稍差,研究皮层和海马结构损伤基本可以满足;长期灌注组结构保留最好,但是耗时长、固定液用量大,致使试验进度慢等缺点不容忽视。,对皮层和海马缺血再灌注损伤研究选择短期灌注取脑尚可满足需要,深部脑白质及核团缺血再灌注损伤研究还是要用长期灌注固定取脑法,或者在取脑后立即根据实验取材要求将脑切成块再浸泡入固定液充分固定。•下面是夹闭腹主动脉:•每只大鼠先快速推注生理盐水50ml冲洗,继而灌注固定液(如4%多聚甲醛等)50~80ml,先快后慢,需10~15min,在灌注固定液过程中,颈部逐渐变硬;灌注结束后,开颅取出脑组织,置于固定液中后固定24h5.体循环与肺循环的鉴别•体循环时大鼠肝脏变白现象出现较早,在灌注多聚甲醛后,四肢会出现明显的抽搐现象,尾巴和四肢明显僵硬。若灌流针误插入右心室,会导致灌流液沿肺循环途径灌流,这时肝脏变白出现的较慢,四肢的抽搐现象没有体循环明显,且鼻腔中有时会有灌流液流出。因肺循环会影响组织器官的灌流效果,因此进针时要准确,避免肺循环的发生。一旦出现肺循环指征,应及时调整进针角度。谢谢！