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中药注射剂指纹图谱研究的技术要求第一部分注射剂用中药材指纹图谱研究概述•质量稳定的原料是生产质量稳定的产品的先决条件。•中药材绝大部分来源于生物,包括植物药和动物药。中药活性成分大部分为生物体内次生代谢产物,少数为初生代谢产物。•产地、气候、生态环境、栽培或养殖技术、产地加工、炮制方法等对中药材的化学成分影响很大。•目前大部分中药的有效成分未被阐明或仅部分阐明。•对中药材或中成药的某个有效成分或指标性成分进行定性、定量分析,不能有效地控制中药材或中成药的质量。中药指纹图谱的定义与特点•定义:中药指纹图谱系指某种(或某产地)中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。•特点:(1)通过指纹图谱的特征性,能有效鉴别样品的真伪或产地;(2)通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定,能有效控制样品的质量,确保样品质量的相对一致。中药指纹图谱的作用•作为药品的质量标准组成部分•企业产品质量的内控标准•企业药品生产的过程控制•企业产品创优或打假中药材指纹图谱的定义:中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。如果原药材需经过特殊炮制(如醋制、酒制、炒炭等),则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。一、中药材指纹图谱的检测标准内容:名称、汉语拼音、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。1、名称、汉语拼音按中药命名原则制定如:黄芪【名称】黄芪【汉语拼音】Huangqi2、来源●原植、动物:科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等。●矿物药:矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。来源•动、植物药材:应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法。•矿物药:固定产地和炮制、加工方法。•供试品的取样:保证供试品的代表性和均一性。如:黄芪【来源】本品为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。【产地】山西、内蒙古、甘肃。【采收期】10月中旬至11月中旬。【产地加工】除去须根及根头,晒干。【炮制方法】除去杂质,大小分开,洗净,润透,切厚片,干燥。其性状、鉴别、检查、含量测定、浸出物等项应符合《中国药典》2000年版一部249页黄芪项下的各项规定。3、供试品的制备•应根据中药材中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要,选择适宜的方法进行制备。•制备方法必须确保该中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。•目前仅要求按注射剂制备工艺制备供试品。4、参照物的制备•制定指纹图谱必须设立参照物。•应根据供试品中所含成分的性质,选择适宜的对照品作为参照物,如果没有适宜的对照品,可选择适宜的内标物作为参照物。•参照物的制备应根据检测方法的需要,选择适宜的方法进行制备。5、测定方法●包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。●应根据中药材所含化学成分的理化性质,选择适宜的测定方法,建议优先考虑色谱方法。●对于成分复杂的中药材,必要时可以考虑采用多种测定方法,建立多张指纹图谱。●以色谱方法制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定;以光谱方法制定指纹图谱,相应条件也必须固定。例:黄芪黄酮及其苷类成分的测定方法照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥD)测定。色谱条件和系统适用性试验色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,型号为Polaris5μC-18-A,250×4.6mm(MetaChem公司产品);流动相为乙氰-水(含0.042%磷酸)(1:4),流速0.8ml/分钟,检测波长225nm;理论塔板数按毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷计,应不低于3000。测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪中,记录60分钟的色谱图,即得。以毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色谱峰(S峰)的相对保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和峰面积比值。6、指纹图谱及技术参数(1)指纹图谱●根据供试品的检测结果,建立指纹图谱。●采用HPLC和GC制定指纹图谱,其记录时间根据样品所含成分的情况而定;采用TLCS制定指纹图谱,必须提供从原点至溶剂前沿的图谱;采用光谱法制定指纹图谱,必须按各种光谱的相应规定提供全谱。●化学成分类型复杂的品种,必要时可建立多张指纹图谱。●指纹图谱的建立:根据10批次以上供试品的检测结果所给出的相关参数,制定指纹图谱。即可以从10批指纹图谱中选择其中一批代表性较强的样品的指纹图谱作为对照指纹图谱;也可以提取计算机相似度评价软件得到的模式图谱作为对照指纹图谱。(2)共有指纹峰的标定•采用色谱方法制定指纹图谱,可采用保留时间或相对保留时间标定指纹峰。(相对保留时间的计算:以参照物的保留时间,计算各色谱峰的相对保留时间。)•光谱法采用波长或波数标定指纹峰。•根据10批次以上供试品的检测结果,标定中药材的共有指纹峰。(3)指纹图谱的评价•以指纹图谱相似度评价软件进行评价•以相对保留时间和峰面积比值进行评价相似度软件评价新疆产红花指纹图谱共有指纹峰面积比值的计算方法•以对照品作为参照物的指纹图谱,以参照物峰面积作为1,计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值;•以内标物作为参照物的指纹图谱,则以共有指纹峰中其中一个峰(要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰)的峰面积作为1,计算其他各共有指纹峰面积的比值。•各共有指纹峰面积比值必须相对固定。峰面积比值的要求:•Ai≥20%At:SD≤±20%•10%At≤Ai20%At:SD≤±25%•Ai10%At:峰面积比值不作要求,但必须标定相对保留时间。•未达基线分离的共有峰,应计算该组峰的总峰面积作为峰面积,同时标定该组各峰的相对保留时间。非共有峰面积中药材供试品的图谱与标准指纹图谱比较,非共有峰总面积不得大于总峰面积的10%。例:黄芪黄酮类成分指纹图谱的技术参数:•共有峰的峰号(相对保留时间):1(0.52),2(0.58),3(0.74),4(0.90),S(1.00),5(1.22),6(1.36),7(2.01),8(3.25),9(3.67),10(4.35),11(5.80),12(7.28)。•峰面积比值:S:7:=(1.000):(0.236~0.394)•部分共有峰的峰形描述:二、起草说明•目的在于说明制定指纹图谱检测标准中各个项目的理由,规定各项目指标的依据、技术条件和注意事项等。•既要有理论解释,又要有实践工作的总结及试验数据。1、名称、汉语拼音•阐明确定该名称的理由与依据。•已有国家标准或地方标准的中药材,应引用标准上的名称。•其他著作或文献上已记载的中药材,应引用文献名,提供依据。•新发现的中药材,应根据中药命名原则进行命名。2、来源•对于多来源的中药材,原则上应固定单一品种。•对于多药用部位的中药材,必须固定单一药用部位。•已有国家标准(包括药典和部颁标准)的中药材,应引用国家标准;已有地方标准的中药材,除引用地方标准外,必须附标准的复印件。•注射剂用中药材一般固定一个产地,如固定多个产地,需制定各产地中药材的指纹图谱。来源●中药材一般固定一个采收期,如固定多个采收期,需制定各采收期药材的指纹图谱。●鼓励建立中药材规范化栽培基地或选用已有的规范化栽培基地生产的中药材。●中药材的炮制必须固定一种方法,并制订严格的炮制技术标准操作规范。应根据《中药材炮制加工规范》进行详细叙述。min0102030405060708090mAU020406080100120VWD1A,Wavelength=330nm(RCR\RCR00055.D)min0102030405060708090mAU0500100015002000VWD1A,Wavelength=330nm(RCR\RCR00066.D)RCR-15min0102030405060708090mAU050100150200VWD1A,Wavelength=330nm(RCR\RCR00082.D)rcr-Csa-3-c-1min0102030405060708090mAU0100200300400500600700VWD1A,Wavelength=330nm(RCR\RCR00047.D)rcr-020504荒漠肉苁蓉管花肉苁蓉沙苁蓉盐生肉苁蓉不同品种的肉苁蓉指纹图谱比较及品种的选定标样叠加图芒柄花素苷异黄烷苷-1异黄烷苷-3毛蕊异黄酮黄芪甲苷芒柄花素毛蕊异黄酮苷黄芪所含主要成分的对照品色谱峰min10203040506070mAU5075100125150175200225ADC1A,ADC1CHANNELA(W:\UHHL3\SHHF0013.D)黄芪甲苷芒柄花素min010203040506070mAU0255075100125150175DAD1E,Sig=280,16Ref=360,100(W:\UHHL3\SHHF0013.D)毛蕊异黄酮苷芒柄花素苷毛蕊异黄酮黄芪药材蒸发光散射检测器检测指纹图谱黄芪药材紫外检测器(280nm)检测指纹图谱7个省皂苷成分甘肃黑龙江陕西其他河北山西内蒙古辽宁不同产地黄芪蒸发光散射检测器检测指纹图谱比较7个省黄酮类成分陕西山西甘肃黑龙江内蒙古河北其他辽宁不同产地黄芪药材紫外检测器检测指纹图谱比较4、8个省50种药材样品指纹图谱考察010002000300040005000600070001611162126313641468个省50种药材样品的紫外检测考察结果条形图(毛蕊异黄酮苷峰面积)8个省50种药材中性成分的考察图谱(黄芪甲苷峰面积)01000200030004000500060007000内蒙古山西黑龙江吉林省甘肃辽宁省陕西河北其他010002000300040005000600070008000内蒙古山西黑龙江吉林甘肃陇西辽宁河北陕西不详01000200030004000500060007000内蒙古山西黑龙江吉林甘肃辽宁河北陕西其他01000200030004000500060007000内蒙古山西黑龙江吉林甘肃辽宁河北陕西其他3、供试品的制备•说明选用制备方法的依据。•供试品需要提取、纯化,应考察提取溶剂、提取方法、纯化方法等,提取、纯化方法应力求最大限度地保留供试品中的化学成分。•供试品需要粉碎检测,应考察粉碎方法、粒度等。4、参照物的制备•参照物的选择及其依据。根据供试品中所含成分的性质,选择适宜的对照品或内标物作为参照物。•试验样品制备的依据。根据检测方法的需要,选择适宜的方法进行制备,说明制备理由。5、检测方法•检测方法的选择•检测方法的原理•色谱条件与系统适用性试验:包括色谱柱、流动相、检测波长、流速、柱温等考察•方法学考察资料和相关图谱(包括稳定性、精密度和重现性)•对于所含成分类型较多的中药材,如一种检测方法或一张图不能反映该中药材的固有特性,可以考虑采用多种检测方法或一种检测方法的多种测定条件,建立多张指纹图谱。min0102030405060708090mAU020406080VWD1A,Wavelength=330nm(RCR\RCR00053.D)RCR-LichrosorbLichrosorb250*4.6mm10μm(大连依利特公司min0102030405060708090mAU020406080VWD1A,Wavelength=330nm(RCR\RCR00054.D)RCR-Dikmamin0102030405060708090mAU020406080100VWD1A,Wavelength=330nm(RCR\RCR00001.D)RCR-MerckDiamasil200*4.6mm5μm(迪马公司)Lichrospher250*4mm5μm(默克公司)1、色谱柱考察肉苁蓉药材指纹图谱研究的色谱柱的考察:min0102030405060708090mAU024681012VWD1A,Wavelength=330nm(RCR\RCR
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