反相高效液相色谱法测定卤肉制品中亚硝酸盐

一.反相高效液相色谱法测定卤肉制品中硝酸盐及亚硝酸盐1实验部分1.1主要试剂与仪器甲醇(光谱纯);去离子水(18.36MΩ／cm);饱和硼砂溶液(50.0g／L，称取5.0硼酸钠(Na2B4O710H2O)，溶于100ml热水中，冷却后备用)亚铁氰化钾溶液(106.0g／L，称取106.0g用水溶解，并稀释至1000ml);醋酸锌溶液(220.0g／L，称取220.0g加30ml冰乙酸溶于水，并稀释至1000ml);硝酸盐标准溶液(200mg／L，准确称取0.2000g于110～120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移于1000ml容量瓶中，并稀释至刻度，至于冰箱保存);亚硝酸盐标准溶液(200mg／L，准确称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解并稀释至500mL);岛津LC-10A液相色谱仪(Class-VP5.0型二极管阵列检测器、LC-10A溶剂输送泵、HS色谱数据工作站V6.2)：0.45um微孔滤膜；艾科浦U系列纯化水机(AWJ2b-10-U)1.2色谱条件色谱柱Shim-packCLC-ODSφ6×150mm;预柱：Shim-packG-ODS;流动相：甲醇+1.25mmol／L混合磷酸盐，含3mmol／L四丁基溴化铵，配比为15+85;流速：1.0mL／min;柱温：25℃；检测波长220nm;进样量：20uL：保留时间定性，峰面积外标法定量。1.3样品预处理称取5g左右样品经绞碎混匀的试样于100mL烧杯中，加12.5mL硼砂饱和液搅拌均匀，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出后冷却至室温，然后一面转动，一面加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL醋酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，静置片刻。取上清夜经0.45μm滤膜滤过，待测。1.4标准曲线的制作配制系列浓度的标准溶液，采用多点线性校正，建立峰面积-浓度标准曲线或直线回归方程。根据IUPAC的规定倍噪音为样品检出限。本方法的线性范围、相关系数、检出限如表1所示。表1方法的线性浓度范围，相关系数和检出限组分线性浓度范围(略)2结果与讨论2.1色谱条件的选择比较了几种比例流动相，分别为甲醇：盐水溶液(10:90)、甲醇：盐水溶液(15:85)、甲醇：盐水溶液(18:82)，发现甲醇：水溶液(15:85)条件下亚硝酸盐及硝酸盐和样品中干扰物能达到较好的基线分离，并且亚硝酸盐峰之前的负峰对测定无干扰；改变流动相流速，当流速为1.0mL／min亚硝酸盐及硝酸盐出峰时间合适，峰形较好；在方法测试条件下，亚硝酸盐和硝酸盐测得的灵敏波长分别为214、213nm，为避免低紫外波长的影响，使色谱基线稳定，故定为220nm［5］。综合考虑，确定测定的色谱条件为：流动相为甲醇：盐水溶液(15:85)，流速1.0mL／min，柱温25℃，检测波长220nm，进样量为20μL，测定结果令人满意。表2精密度试验结果(略)2.2精密度和回收试验精密度试验分别配制低、中、高浓度三种标准溶液，各进行7次测定，亚硝酸盐RSD为0.45％～2.6％，硝酸盐RSD为0.36％～2.0％，结果见表2;采集市场售卖的卤肉制品，加入不同量的标准溶液进行测定，亚硝酸盐回收率为88.9％～99.1％，硝酸盐回收率为86.3％～98.6％，结果见表3。表3样品中亚硝酸盐和硝酸盐加标回收率试验结果(略)2.3方法可靠性试验对同—样品用本法与国标法同时测定亚硝酸盐和硝酸盐两组分，通过F检验和t检验，本法与国标法所测定的结果均无显著性差异，并且操作简便，易于掌握。结果见表4。表4样品中亚硝酸盐和硝酸盐含量两种方法的测定结果比对(略)3小结本法能够同时测定卤肉制品中硝酸盐和亚硝酸盐含量，具有快速、准确、灵敏、线性范围大等优点，样品中的其他组分如色素、动物性蛋白等对其检测不构成干扰，与国家标准法比较，测定结果无显著性差异。对已装备了液相色谱仪的实验室，本方法扩展了仪器的检测范围，并且大大提高工作效率，很值得推广。二.反相高效液相色谱法同时测定酱腌菜中亚硝酸盐和硝酸盐1材料与方法1·1主要仪器与试剂Agilent1100分析型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),包括AgilentChemStation色谱工作站、四元梯度泵、真空脱气箱、恒温柱温箱、可变波长检测器(VWD)。色谱柱:250×4·6mm,5μm,CapcellPAKC18柱。MilliporeMilli-Q系统(MolsheimFrance),CQ-6超声波清洗器(上海沪超超声波仪器有限公司),pHS-3F酸度计(上海电子光学技术研究所)。Envi-Carb柱(Supelco)及PreIC-Ag和PreIC-Na联合柱(AglelaTechnologies)。硝酸钠、亚硝酸钠、磷酸均为分析纯,磷酸二氢钾为优级纯。以下溶液均用电阻率为18·2MΩ·cm的去离子水配制:NO-2标准溶液(100mg/L);NO-3标准溶液(100mg/L);0·02mol/L磷酸二氢钾-磷酸缓冲溶液(pH=3·20),过0·45μm滤膜,超声脱气30min。测定用样品购自当地市场。1·2色谱条件流动相为0·02mol/L的KH2PO4-H3PO4缓冲液(pH=3·20);流速1·0ml/min;柱温:室温;检测波长为210nm;进样量:20μl。1·3样品前处理以四分法取样,按比例加入一定量水(称取试样时应扣除加水量),用高速组织捣碎机制成匀浆样品。称取5g(精确到0·01g)匀浆试样于150ml锥形瓶中,加入70℃~80℃纯水50m,l超声提取15min,待溶液冷却后转移至200ml容量瓶中,用纯水定容,静置(若样品浑浊需离心分离),取上清液以低于2ml/min的流速过Envi-Carb柱(Supelco)及PreIC-Ag和PreIC-Na联合柱(AglelaTechnologies),滤液过0·22μm滤膜,待测。1·4样品分析采用2种方法对样品中的NO-2和NO-3进行定性。在相同的色谱条件下,将样品的色谱图与标准溶液的色谱图对照,根据色谱峰的保留时间确定;在样品中加入NO-2和NO-3的标准溶液,根据峰高的突增进一步验证色谱峰的归属。采用峰面积外标法定量。2结果与讨论2·1色谱条件的选择2·1·1最大吸收波长的选择分别取1·0mg/LNO-2和NO-3标准溶液在紫外可见分光光度计上扫描,在190~230nm波长范围内,NO-2和NO-3标准溶液均有吸收。进一步经HPLC分离后于不同的波长下测定,见图1。结果表明:两种物质均在210nm波长有最大吸收,因此选择检测波长为210nm。2·1·2流动相pH对分离的影响在pH计上用稀磷酸调节流动相的pH分别为3·00、3·20、3·30、3·50,进行分离测定,结果见图2。在流动相pH为3·20时,分离度最大,因此选择pH=3·20。图2流动相pH对分离的影响2·1·3流动相浓度对测定的影响实验表明,随流动相中磷酸盐浓度增大,峰面积增加,灵敏度增加,见图3。因此选择磷酸盐浓度为0·02mol/L图3流动相浓度对测定的影响根据以上分析结果,选择优化的色谱分离条件:流动相为0·02mol/LKH2PO4-H3PO4缓冲液(pH=3·20),检测波长为210nm,流速为1·00ml/min,柱温为室温。NO-2和NO-3混合标准的分离色谱图如图4。图4标准溶液色谱图a·1·00mg/LNO-3;b·1·00mg/LNO-22·2样品处理方法样品加入热水后,预试超声提取15min和80℃水浴30min,结果没有明显差异。酱腌菜提取液中存在大量有机化合物,如色素、淀粉、蛋白质、糖类、有机酸等,如不去除,会缩短色谱柱使用寿命,可用吸附柱消除。由于酱腌菜中含有高浓度的盐分,可用银柱消除。本法采用分别过Envi-Carb柱(Supelco),C18柱(Waters)及PreIC-Ag和PreIC-Na柱串联柱(AglelaTechnologies),用标准混合溶液进行测定,结果见表1,回收率在91%~100%。处理实际样品石墨化碳黑柱对色素及有机物的吸附能力较强,流出液几乎无色,同时采用Pre-IC-Ag和PreIC-Na柱去除高浓度盐分,可得到较好的结果。考虑到分析成本,本文采用石墨化碳黑柱和PreIC-Ag和Pre-IC-Na柱处理样品。实际样品分离色谱图见图5。表1色谱前处理柱回收效率(%)检测离子Envi-Carb柱C18柱PreIC-Ag和PreIC-Na柱NO-29710091NO-39610095图5实际样品分离色谱图2·3方法的线性范围、标准曲线、检测限采用本方法测定NO-2和NO-3的线性关系和最低检出限等指标,结果见表2。以3倍信噪比计算,NO-2和NO-3的最小察提取时间对不同提取溶剂的提取效果的影响,分别选取5、10、15、20、30min来分别测定乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷的提取效果。从图5中可以看出5种提取溶剂在0~15min提取效率随着提取时间的增加而增加,当提取时间大于15min,其提取时间对提取效果影响不大。图5提取时间对不同溶剂提取效果的影响从对不同提取温度、提取时间对辅酶Q10提取效果的影响试验中可以看出,在相同的提取温度和提取时间下,三氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷这3种溶剂提取率相差不大;但由于这三者的毒性依次为三氯甲烷正己烷乙酸乙酯,因此,选择乙酸乙酯为辅酶Q10的提取溶剂,提取时间15min,提取温度40℃。2·3样品的测定平行取5份“升态微丸”样品,分别按照上述2·2、2·1定的提取和分析条件测定,结果表明,提取率96%,相对标准偏差2·83%。2·4精密度、准确度试验取两份不同的样品,加入标准溶液,按样品测定方法进行分析,结果表明:亚硝酸盐和硝酸盐加标回收率分别为90·6%~101·3%和96·6%~104·8%,相对标准差为5·0%和3·3%。2·5实际样品测定采用本分析方法对部分市售样品进行测定,结果见表3。以我国的国家标准中规定的酱腌菜中亚硝酸盐(以NaNO2计)含量不得超过20mg/kg[9]来衡量,所测五份样品的亚硝酸盐含量均末超标。表3实际样品中NO-2和NO-3含量(mg/kg)阴离子样品1样品2样品3样品4样品5NO-24·942·18NDND5·76NO-32468150668·8177596三.高效液相色谱法测定自来水和蔬菜中的硝酸盐和亚硝酸盐[英]/BlancoD…∥JLiquidChro-matogr.-1995,18(12).-2445～2456色谱条件:流动相为0.030mol/LKH2PO4-H3PO4缓冲溶液(pH=3.5),流速为1.5ml/min,流动相使用前经0.22μmNylon滤器进行真空过滤并且用氦气进行脱气。测定条件:室温(20±2℃),检测波长为210nm。标准溶液:KNO3(Sigma公司)和NaNO2(Sigma公司)均由超纯水配制,浓度为100mg/L。向亚硝酸盐溶液中加入5ml0.2mol/L的NH4Cl-NH3缓冲液(pH=9)以避免NO-2的氧化。溶液在低于4℃条件下保存。自来水采用Millex滤纸除去颗粒物后可直接进样。将50g莴苣内叶和外叶洗净,切成小于1cm的碎块,在Polytron混合器中搅匀5min。取1g代表性样品用30ml水和0.5ml100g/LNaOH溶液进行稀释和提取。混和物在50℃～60℃保持15min,加入4.5mlNaOH溶液和6ml300g/LZnSO4溶液,悬浮液在50℃～60℃条件下再保持15min,将混和物冷至室温,离心,用碱性水溶液洗涤2次,用水稀释至100ml。提取液通过0.22μm滤膜后进行分析。取0.5g纤维状苹果树叶样品,用10ml水、20ml20g/L的四硼酸钠、5ml150g/LK4Fe(CN)6和5ml300g/LZnSO4溶液进行稀释和提取,混合液如上进行加热和离心后用水稀释至50ml,提取液经0.22μm滤膜过滤、C18柱固相萃取进行净化,以除去某些干扰化合物,然后进样。整