干旱胁迫对植物生理生化指标的影响

1干旱胁迫对植物生理生化指标的影响摘要：水是生命之源，地球上任何生物的生存都离不开水。并且，很多生物在出现缺水时都表现出一系列相应的症状，特别是植物最明显。植物常常遭受的有害影响因素之一就是缺水，当植物消耗的水分无法从外界得到补充时，就会使植物体内的一些生理生化指标发生变化，如脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)等的含量。实验通过分光光度计分别在不同的波长中测出吸光率，间接计算出其含量，我们通过测定这些指标含量的变化就可以知道干旱对植物的损伤有多严重。植物经常遭受干旱胁迫的危害，全世界干旱、半干旱地区的面积占总面积的43%，而中国更为严重，约占51.9%，因而研究植物的抗旱性尤为重要。由实验数据可知，当小麦受到干旱胁迫时，小麦幼苗的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)的含量均升高。关键词：干旱、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)1.引言1.1干旱及干旱对植物的影响干旱化已成为世界性的问题，中国干旱半干旱地区面积为256．6×104km2，占国土面积的26.73％。在我国各干旱省份中，云南又属于干旱的省份之一。对植物影响的诸多自然因素中，干旱占首位。因此研究干旱对植物的影响就尤为重要，以利于应用于农作物上。在农业上可以采取植物的各种抗旱机制来抵抗干旱对农作物的损伤，才不致使庄稼减产，利于丰收。那么，究竟什么算干旱呢？就让我们来看看它的定义吧！当植物耗水大于吸水时，就会使组织内水分亏损，简而言之，过度水分亏缺的现象，称为干旱。干旱可分为大气干旱和土壤干旱。土壤干旱时，植物生长困难或完全停止，受害情况比大气严重。我国农业每年受旱灾面积达2500多万km2。[1]水分在植物的生命活动中起着极大的作用,全世界由于水分亏缺导致的减产2超过其他因素造成的减产的总和[2]。大多数植物遭受干旱逆境后各个生理过程都会受到不同程度的影响。随着干旱时间的延长，植物可吸收的水分越来越少。因此，植物的一些生理生化指标都发生了一定程度的变化。1.2实验的目的及意义希望可以通过本次实验让我们掌握干旱胁迫下植物的一些生理生化指标的测定方法，并且通过测定这些指标含量的变化来了解干旱对植物的伤害有多严重，及干旱胁迫对植物的伤害原因及研究其抗旱机理。当知道植物的抗旱机制后我们就可以利用其抗旱机制，采取相应的措施来保护植物了，特别是一些农作物和一些景观植物。2.材料与方法2.1材料植物材料：小麦种子、玉米种子；主要试剂：0.1%HgCl2，TTC，3%磺基水杨酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8)，0.6%TBA（用0.6%TCA配制），PBS(pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]，PBS,（pH=5.8,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP），POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解），PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS(pH=7.7)，4mMDTNB(用0.1MpH=6.8PBS现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。2.2实验种子的处理：品种为晴3或鲁玉13的玉米种子或小麦种子（购于西山种子公司）→用0.1%HgCl2消毒10min后→用蒸馏水漂洗干净→用蒸馏水于26℃下吸涨12h→播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm×16cm）中→于26℃下暗萌发60h→计算发芽率（注意与前面结果比较）→选取长势一致的玉米幼苗做干旱5天、高温、盐渍或3低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。种子发芽率的测定：各取50粒吸胀的玉米种子或小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴20min），取50个半粒进行曙红染色（室温染色10min）→洗净后观察。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。2.3实验方法及步骤（1）、脯氨酸(Pro)含量的测定Pro的提取：分别取0.1g实验组和对照组的幼苗→加入3mL3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。测定：上清液各2mL→分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min（若没沉淀可略此步骤）→分别测定A520计算：（2）、丙二醛(MDA)含量的测定MDA提取：分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL10%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2mL10%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。测定：分别取上清液各2mL→加入0.5%TBA（用10%TCA配制）2mL→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心5min（视沉淀有无）→分别测定OD450和OD532。计算：OD450=C1×85.44OD532=C1×7.4＋155000×C2解得：C1／（mmol／L）=11.71OD450C2／（mmol／L）=6.45OD532-0.56OD450(式中，C1为可溶性糖浓度，C2为MDA的浓度。)（3）过氧化氢(H2O2)含量的测定H2O2提取：分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL0.3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mLTCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。测定：分别取上清液各4mL→加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]0.2mL→摇匀→OD410计算：（4）、抗氧化酶含量的测定抗氧化酶的提取：分别取0.1g实验材料→加入少许石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH6.0,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP）→充分研磨→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积→用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。（5）、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)含量的测定POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）3ml，加入酶液50μl（空白调零用提取液取代），立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5min时的A470。PPO测定：取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）3ml，加入酶液0.1ml（空白调零用提取液取代），立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5min时的A410。5以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：（6）、谷胱甘肽(GSH)含量的测定GSH的提取：分别取0.1g实验组和对照组的幼苗→加入3mL3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。测定：上清液各2mL(空白用3%三氯乙酸代替)→分别加入0.4mL1MNaOH→1mL2mMDTNB→25℃5min→测定A412计算：3.实验结果及分析：（1）发芽率的测定：小麦：TTC染色法：48个具有活力，因此其发芽率为：48/50×100%=96%；曙红染色法：50个具有活力，因此其发芽率为：50/50×100%=100%。玉米：TTC染色法：45个具有活力，因此其发芽率为：45/50×100%=90%；曙红染色法：47个具有活力，因此其发芽率为：47/50×100%=94%。分析：两种方法测定的发芽率不一样，可能是因为：由数据可以看出，TTC染色的种子发芽率普遍比曙红染色的低，可能是因为TTC染色法的染色部位是胚，曙红染色法的染色部位是胚乳，并且在种子中胚比胚乳小很多，有的种子被虫吃了一部分，或者是切种子的时候另一半没有切到胚，影响观察结果，所以TTC染色的发芽率比曙红染色的低。（2）脯氨酸（Pro）含量测定：A520V总V显V用Procontent6干旱组1.2964.6ml6ml2ml55.20mol.g-1FW对照组0.0474.9ml6ml2ml2.13mol.g-1FW计算过程：根据公式：（式中ε=3.24mol.cm，L=1cm,W=0.1g）带入数据可求得Procontent。计算结果为干旱组脯氨酸含量为55.2mol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为2.13mol.g-1FW.实验组与对照组比较，可以看出实验组的脯氨酸含量是对照组的25.9倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中Pro含量迅速上升。（3）丙二醛（MDA）含量的测定：OD532OD450C1C2干旱组0.3470.95411.170mmol/L1.704mmol/L对照组0.0430.0510.597mmol/L0.249mmol/L计算过程：根据公式：OD450=C1×85.4OD532=C1×7.4＋155000×C2解得：7C1／（mmol／L）=11.71OD450C2／（mmol／L）=6.45OD532-0.56OD450(式中，C1为可溶性糖浓度，C2为MDA的浓度。)可计算出C1，C2的值。计算结果为干旱组的MDA的浓度为1.704mmol/L，对照组的MDA的浓度为0.249mmol/L，干旱组为对照组的6.8倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中MDA含量比正常生长的含量高。（4）H2O2测定：V总V用V显OD410H2O2content干旱组4.8ml4ml4.2ml0.6389.924mol.g-1FW对照组4.7ml4ml4.2ml0.4762.305mol.g-1FW计算过程：根据公式：（式中ε=3.24mol.cm，L=1cm,W=0.1g）带入表中的数据即可算出H2O2content。8计算结果得到干旱组中H2O2为9.924umol.g-1FW，对照组中H2O2为2.305umol.g-1FW，干旱组为对照组的4.3倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中H2O2含量上升。（5）POD的测定:V总V显V用干旱组5.5ml3.05ml3ml对照组5.2ml3.05ml3mlPOD在不同时间的A470值：0.5min1.5minPODactivities（t=0.5min）PODactivities(t=1.5min)干旱组0.1120.2533.87umol.g-1FWmin-12.91umol.g-1FWmin-1对照组0.0970.2283.17umol.g-1FWmin-12.48umol.g-1FWmin-1计算过程：根据公式：（式中ε=3.24mol.cm，W=0.1g）可计算分别出PODactivities。9由上表可知，当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，过氧化物酶（POD）含量上升。（6）PPO的测定：V总V显V用干旱组5.1ml3.1ml3ml对照组4.7ml3.1ml3mlPPO在不同时间的A410值：0.5min1.5minPPOactivities（t=0.5min）PPOactivities（t=1.5min）干旱组0.1210.139411.4U.g-1FW157.5U.g-1FW对照组0.1020.109319.6U.g-1FW113.8U.g-1FW计算过程：根据公式：可算出PPOactivities。10由上表可知，当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，多酚氧化酶(PPO)含量明显上升。（7）GSH的测定：V总V用V显A412GSHcontent干旱组4.1ml2ml3.4ml0.80217.25umol.g-1FW对照组4.4ml2ml3.4ml0.1112.56umol.g-1FW计算过程：根据公式：（式中ε=3.24mol.cm，L=1cm,W=0.1g）带入表中的数据即可算出GSHcontent。由上述计算结果可知受到干旱胁迫的小麦幼苗的胚芽鞘中GSH含量是正常生长的6.7倍左右，表明遭受干