咳嗽敏感性增高豚鼠模型两种造模方法比较研究-王谦

92第19卷第5期2017年5月辽宁中医药大学学报JOURNALOFLIAONINGUNIVERSITYOFTCMVol.19No.5May，2017我国自2005年制定《咳嗽的诊断与治疗指南（草案）》以来，慢性咳嗽（Chroniccough）尤其是不明咳嗽敏感性增高豚鼠模型两种造模方法比较研究王谦1，史利卿2，马建岭2，季坤2，温绍惠2，林彬1，杨凯1，宋欢1，白逸晨1，邸洁2，孙静宜2（1.北京中医药大学，北京100029；2.北京中医药大学东方医院，北京100078）摘要：目的：比较咳嗽敏感增高豚鼠模型两种造模方法的优劣。方法：选用SPF级Hartley雄性豚鼠30只，随机分成两组，每组15只，分别为模型Ⅰ组和模型Ⅱ组。模型Ⅰ为环磷酰胺加高剂量卵蛋白腹腔注射主动免疫，模型Ⅱ为低剂量卵蛋白腹腔注射主动免疫，余方法一致。雾化激发后，两组豚鼠予以500μmol/L辣椒素溶液雾化吸入2min，记录雾化后3min内的咳嗽频次。两组豚鼠用10%水合氯醛，0.4mL/100g麻醉后，插管上机，颈静脉注射生理盐水及不同浓度乙酰甲胆碱溶液进行气道激发，并测定其阻力。结果：辣椒素雾化测定咳嗽频次方面，Ⅰ组和模型Ⅱ组比较，无明显差异（P0.05）；在生理盐水和不同乙酰甲胆碱溶液浓度进行激发气道阻力测定方面，生理盐水、乙酰甲胆碱400mg/L、800mg/L，3组无明显差别（P0.05），在乙酰甲胆碱100mg/L、200mg/L激发时，模型Ⅱ组气道阻力远大于模型Ⅰ组（P0.05）。结论：咳嗽敏感增高豚鼠模型Ⅰ与模型Ⅱ在咳嗽敏感性方面无明显差别，但模型Ⅱ的气道收缩反应更为强烈，较低浓度乙酰甲胆碱就使气道阻力达到峰值，而模型Ⅰ豚鼠气道阻力随着乙酰甲胆碱浓度增高而平缓上升，能够很好模拟咳嗽敏感性增高。关键词：咳嗽敏感性增高豚鼠模型；咳嗽变异性哮喘；动物模型；风邪伏肺中图分类号：R256.11文献标志码：A文章编号：1673-842X(2017)05-0092-04收稿日期：2016-10-11基金项目：国家自然科学基金资助项目（81373588）作者简介：王谦（1987-），男，山西太原人，博士研究生，研究方向：中医药治疗呼吸系统疾病临床及实验室研究。通讯作者：史利卿（1965-），男，北京人，教授，博士研究生导师，博士，研究方向：中医药治疗呼吸系统疾病临床及实验室研究。E-mail：[e-mail]。ComparativeStudyofTwoMethodsofMakingModeloftheCoughSensitivityIncreasedGuineaPigWANGQian1，SHILiqing2，MAJianling2，JIKun2，WENShaohui2，LINBin1，YANGKai1，SONGHuan1，BAIYichen1，DIJie2，SUNJingyi2（1.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China；2.DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China）Abstract：Objective：Tocomparetheadvantagesanddisadvantagesoftwomethodsofmokingcoughsensitivityincreasedguineapigmodel.Methods：30maleHartleyguineapigswithSPFgradewererandomlydividedintotwogroupswith15guineapigsineachgroup.ModelⅠ：Usingcyclophosphamideandhigherdoseovalbumin（OVA）tointraperitoneallyinjectforactiveimmunization；ModelII：UsinglowerdoseOVAtointraperitonealinjectforactiveimmunization.Thereststepswerethesame.Aftertheatomizationexcitation，thetwogroupsofguineapigsweregiven500μmol/Lcapsaicinsolutiontoatomizinginhalationlasting2min，andtonumberthetimesofcoughin3minafteratomizeinhalation.Toanaesthesiatwogroupsofguineapigswith10%chlorinehydrate（0.4mL/100g）.Then，intubatingtheguineapigs'tracheaandconnectingtotheanimalrespirator.Makingtheairwayexcitationonthemachine，theairwayexcitation，andthedeterminationofitsresistance.Injectingnormalsalinesolutionanddifferentconcentrationofmethacholineinthejugularveintostimulatetheairwayandmeasuretheresistance.Results：Inthecomparisonofcoughfrequency，usingcapsaicinatomization，modelIgroupandmodelIIgroupwerenosignificantdifference（P0.05）；Inthemeasurementofairwayresistancewithinairwaystimulating：physiologicalsaline，methacholinesolutionof400mg/Land800mg/L，thethreegroupshadnosignificantdifference（P0.05），andinmethacholinesolutionof100mg/Land200mg/L，airwayresistanceofthetwogroupsarefarsignificantdifferent（P0.05）.Conclusion：Incoughsensitivityaspect，therewasnosignificantdifferencebetweencoughsensitivityincreasedguineapigmodelIandmodelII，butairwayconstrictionofmodelIIinresponseofmethacholinesolutionwasstronger，andlowconcentrationsofmethacholinesolutionmakeairwayresistancereacheditspeakinmodelII.InmodelI，airwayresistanceofguineapigwasgraduallyincreasingwiththeconcentrationofmethacholinesolutionincreasing.ThemethodIcouldsimulatethecoughhypersensitivitybetter.Keywords：coughsensitiveincreasedguineapigmodel；coughvariantasthma；animalmodel；incubativewindinlungDOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2017.05.0249319卷辽宁中医药大学学报原因的慢性咳嗽（Unexplainedchroniccough）逐渐受到专家的重视，《咳嗽的诊断与治疗指南》（2015）[1]认为咳嗽敏感性增高是慢性咳嗽的重要特征，常见的慢性咳嗽，如咳嗽变异型哮喘（Coughvariantasthma，CVA）等均能出现咳嗽敏感性增高，并且提出了“咳嗽高敏综合征”[2-5]的概念。咳嗽敏感性增高豚鼠模型常用于咳嗽变异型哮喘（Coughvariantasthma，CVA）、变应性咳嗽（Atopiccough，AC）[6]的实验室研究。咳嗽敏感增高豚鼠模型通过主动免疫及外源性刺激的方式造成豚鼠气道上皮损伤，刺激神经元释放活性物质，造成咳嗽敏感性增高。但是，此模型的建立存在一些争议：（1）主动免疫过程中，对豚鼠腹腔注射卵蛋白浓度的选定，不同文献有不同的剂量[7-9]。（2）防止豚鼠产生强烈的致敏，给予环磷酰胺腹腔注射来减轻致敏状态[10-13]，或减少卵蛋白腹腔注射量来减轻致敏状态[14]。本研究比较两种模型，模型Ⅰ为免疫抑制+大剂量卵蛋白免疫，模型Ⅱ为小剂量卵蛋白。比较两种模型豚鼠的咳嗽频次和气道激发情况，从而得出较佳的咳嗽敏感性增高豚鼠模型造模方法。1材料1.1动物雄性健康SPF级Hartley豚鼠，30只，体重250~300g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：[动]SCXK（京）2012-0001。常规饲养于北京中医药大学清洁剂动物房，12h光照和夜循环，温度（22±2）℃，湿度50%~60%。饲喂经Co60消毒豚鼠维持饲料，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证编号：[动]SCXK（京）2014-0008。饮水为消毒水。1.2试剂和仪器1.2.1卵蛋白Sigma公司，批号：SLBK1399V。氢氧化铝：国药集团化学试剂有限公司，批号：20131125。水合氯醛：索莱宝（Solarbio）公司，生产批号：811B027。辣椒素：Sigma公司，批号：048K5058V。吐温80液：Sigma公司，生产批号：BCBN1292V。无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司，批号：20140910。环磷酰胺：普德药业，0.2g，生产批号：04150101。1.2.2辣椒素溶液配制取辣椒素30.5mg，加入吐温80溶液1mL、无水乙醇1mL溶解，再加入生理盐水8mL，配成0.01mL/L的辣椒素原液，取1mL原液，稀释至20mL，配成500μmol/L的辣椒素溶液。1.2.3乙酰甲胆碱溶液用乙酰甲胆碱40mg加入50mL生理盐水，配制成800mg/L的乙酰甲胆碱溶液，取25mL稀释至50mL得到400mg/L的乙酰甲胆碱溶液，依次稀释，分别得到200mg/L、100mg/L乙酰甲胆碱溶液。1.2.4雾化器美国Devilliis公司生产Devilliiss646型雾化器，雾化器输出流量0.037mL/min。1.2.5小动物肺功能仪北京贝兰博科技有限公司生产AniRes2005动物肺功能仪及分析软件系统。2方法2.1造模选用SPF级Hartley雄性豚鼠30只，随机分成两组，每组15只，分别为模型Ⅰ组和模型Ⅱ组。模型Ⅰ组第1天腹腔内注射免疫抑制剂环磷酰胺（30mg/kg），第3天腹腔注射卵蛋白2mg和氢氧化铝100mg混合液，第4周第1天腹腔注射0.01mg卵蛋白和100mg氢氧化铝混合液以加强免疫免疫反应。模型Ⅱ组第3天腹腔注射卵蛋白1mg和氢氧化铝100mg混合液，第4周第1天腹腔注射0.01mg卵蛋白和100mg氢氧化铝混合液以加强免疫免疫反应。第7周第1天将两组豚鼠置入自制雾化箱（1m×1m×1m）内给予10g/L卵蛋白溶液雾化吸入60s激发咳嗽，造模完成。2.2咳嗽频次第7周第1天，将豚鼠放入自制雾化箱内，雾化吸入500μmol/L的辣椒素溶液2min，取出，由专门人员计数3min内咳嗽次数。豚鼠咳嗽时，有伸出前脚、颈部伸向前、张口等特征性体位出现，即可记录一次。2.3激发试验气道阻力测定各组豚鼠予以10%水合氯醛按0.4mL/100g腹腔注射麻醉，游离气管及颈外静脉，行