流式细胞术原理及基本应用

流式细胞术原理及基本应用孙继萃2011-3-3流式细胞仪工作原理简介•流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。•研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等。•研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。为什么要使用流式细胞术•快速能够检测样本100个/秒•准确可以获取大量样本以提高实验的统计学准确度•敏感比肉眼更为敏感•高效可同时检测多个参数流式细胞仪的基本构成荧光信号—电信号—数字信号现在普遍使用的激光器•–488nmBlue（可以激发90%以上的荧光染料）•–633nmRed(激发APC染料)•–405/407/408nmViolet•–532nmGreen•325nmUVorMLUV(ForDAPI,Hoechst33342)散射光信号荧光信号荧光信号–FL1:(525nmBP)forgreendyes–FL2:(575nmBP)foryellowdyes–FL3:(615nmBP)fororangedyes–FL4:(675nmBP)forreddyes–FL5:(750nmBP)fordeepreddyes流式细胞仪主要组成原件•液流系统•光学系统•电子系统•计算机系统•分选系统液流系统：流体动力聚集液流系统：流体动力聚集SheathSample光学系统LaserFSCdetectorSSCdetector光学系统：利用濾片將螢光區分至個別的偵測器中电子系统：光电倍增管（PMT）和放大信号（HighVoltage）明确的概念•激发光：激光器发射，单波长光源•发射光：荧光信号的接收器接收，宽频波长信号•信号放大HighVoltage可调节流式细胞术的基本应用•单一细胞的单荧光染色•双荧光及多荧光染色•细胞周期测定单一细胞的单荧光染色什么是荧光强度？双荧光及多荧光染色71.14%20.79%为什么我们需要进行荧光信号的补偿调节FL1 PMT：92＝90+2FL2 PMT：100＝85+15细胞周期检测•原理•PI,即碘化丙锭,可以与细胞内DNA和RNA结合,PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率。细胞周期检测G0/G1PhaseSPhaseG2/MPhase分析中常用参数GMean分析中常用参数%Gated如何做好一个流式检测？•设立一个合适的检测方案•调节散射光信号，让目的细胞群得以完整的呈现•圈定目的细胞群，并观察目的细胞群内各个荧光的表达状况用裸细胞调节阴性细胞群的电压位置用同型对照抗体标记标本修正电压位置阳性标本结果确认•如果涉及到两种以上荧光的检测，需要进行荧光补偿的修正,并要注意荧光染料的搭配。谢谢大家！！！