流式细胞术的基本原理及其应用

流式细胞术基本原理及应用漆冬梅流式细胞仪（flowcytometer）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。台式机、临床型大型机、科研型目前最新型流式仪流式细胞术（flowcytometry）利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。流动室与液流系统光源与光学系统信号收集与信号转换系统计算机与分析系统分选系统流式细胞仪基本结构流式细胞仪的液流系统激光器流动室检测点流式细胞仪的光学系统光电转换器件流式细胞仪的光信号1.散色光信号•前向角散色（ForwardScatter，FSC）小角散色，与细胞直径成近似直线关系。•侧向角散色（SideScatter，SSC）90°散色，与细胞内颗粒结构的质量成近似直线关系。物理属性：用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异利用FSC/SSC可将混合细胞分群R1粒细胞群R2淋巴细胞群R3单核细胞群R4红细胞裂解碎片和少量血小板图注：为外周血白细胞分群情况。由于淋巴细胞体积较小，细胞内颗粒较少，故其分布处于FSC、SSC都较小的区域，即R2区；粒细胞体积较大，细胞内颗粒较多，故其分布处于FSC、SSC最大的区域，即R1区；单核细胞体积较大，细胞内颗粒较粒细胞少，淋巴细胞多，故其分布于二者之间。2.荧光信号荧光素与特异抗体结合荧光素吸收激光能量，发生能量跃迁，产生荧光荧光信号被特定波长的光学元件传递到信号收集器中（PMT），形成信号脉冲。每种颜色的荧光占用一个特定波长的检测器，即荧光通道。化学属性荧光标记抗体与细胞结合原理模式图常用抗体标记荧光染料的特性及其应用荧光染料激发波长/nm发射波长/nm颜色FITC488525绿色PE488575橙黄色PerCP488677深红色APC633660红色BDLSRⅡ四种激光器355nm405nm488nm633nm可进行多达10色以上的多色荧光分析流式细胞术的应用细胞表面分子细胞内或细胞核内抗原细胞凋亡DNA含量检测与细胞周期的分析细胞增殖细胞毒的检测与分析可溶性蛋白分子报告基因其它样品处理全血直接标记法溶血：红细胞裂解液膜表面抗原染色：孵育温度、时间、对照固定与透膜：固定剂、透膜剂细胞内抗原染色：透膜上机检测：加入PBS200-500μl，上机检测。如不能及时上机检测，则加入0.5ml1%多聚甲醛，混匀后置于4度冰箱内保存后检测。(24h内)