HJT3472007水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法试行

I本电子版为发布稿。请以中国环境科学出版社出版的正式标准文本为准。HJ中华人民共和国环境保护行业标准HJ/T347─2007水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）Waterquality—Determinationoffecalcoliform—manifoldzymotechnicsandfiltermembrane（发布稿）2007-03-10发布2007-05-01实施国家环境保护总局发布IHJ/T347—2007目次前言…………………………………………………………………………………………………Ⅱ第一篇多管发酵法1适用范围………………………………………………………………………………………12原理……………………………………………………………………………………………13培养基和试剂…………………………………………………………………………………14步骤……………………………………………………………………………………………25结果的计算……………………………………………………………………………………2第二篇滤膜法1适用范围………………………………………………………………………………………42原理……………………………………………………………………………………………43培养基和试剂…………………………………………………………………………………44步骤……………………………………………………………………………………………55结果的计算……………………………………………………………………………………6II前言为规划《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）的实施工作，制定本试行标准。本标准规定了地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的多管发酵法和滤膜法。本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。本标准为首次制订。本标准由国家环境保护总局科技标准司提出。本标准由国家环境保护总局水和废水监测分析方法编委会组织中国环境监测总站等单位起草。本标准国家环境保护总局2007年3月10日批准。本标准自2007年5月1日起实施。本标准由国家环境保护总局解释。1水质粪大肠菌群的测定粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法。第一篇多管发酵法1适用范围本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。2原理多管发酵法是以最可能数（mostprobablenumber）简称MPN来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。3培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。3.1单倍乳糖蛋白胨培养液：成分：蛋白胨10g牛肉浸膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL蒸馏水1000mL制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。3.2三倍乳糖蛋白胨培养液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。23.3EC培养液：成分：胰胨20g乳糖5g胆盐三号1.5g磷酸氢二钾（K2HPO4）4g磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g氯化钠5g蒸馏水1000mL制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。3.4培养基的存放在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。4步骤4.1水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL或0.1mL、0.01mL、0.001mL等。使用的水样量可参考下表1。表1接种用水量参考表接种量(mL）水样种类检测方法100501010.110-210-310-410-5井水多管发酵法×××河水、塘水多管发酵法×××湖水、塘水多管发酵法×××城市原污水多管发酵法×××如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL中。4.2初发酵试验将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。4.3复发酵试验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。5结果的计算根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表2或表3中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为100mL2份、10mL10份、总量300mL时，查表2可得每升水样中的粪大肠菌群；接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，查表3求得MPN指数，MPN值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。3如果接种的水样不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表3求得MPN值，再经下式计算成每100mL的MPN值。()()mLmL10MPNMPN接种量最大的一管指数值×=表2粪大肠菌群检数表（接种水样100mL2份、10mL10份、总量300m）100mL水量的阳性瓶数01210mL水量的阳性管数1L水样中粪大肠菌群数1L水样中粪大肠菌群数1L水样中粪大肠菌群数03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230表3最可能数（MPN）表（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95％可信限值）出现阳性份数95%置信区间出现阳性份数95%置信区间10mL管1mL管0.1mL管每100mL水样中细菌数的最可能数下限上限10mL管1mL管0.1mL管每100mL水样中细菌数的最可能数下限上限00024212697800120.574302798001020.5743133119302040.51144034129310020.575002377010140.51150134118911040.511502431511011160.51551033119312060.515511461612020050.51351263211502017117520491713021071175217023170211922152294282202209221530792519042301232853111031250300811953214037310301112255331804450031011225540130353003111443454117043190320144345422205770032117546543280908503301754654435012010004001333155024068750401175465513501201000410175465525401801400411217635539203003200412269785541600640580042022767555≥2400第二篇滤膜法1适用范围本标准适用于一般地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。用于检验加氯消毒后的水样时，在滤膜法之前，应先做实验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。2原理滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45μm）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M−FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。3培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。3.1M−FC培养基：成分：胰胨10g蛋白胨5g酵母浸膏3.0g氯化钠5.0g乳糖12.5g胆盐三号1.5g1%苯胺蓝水溶液10mL1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10mL蒸馏水1000mL制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节pH为7.4，5分装于小烧瓶内，每瓶100mL，于115℃灭菌20min。贮于冰箱中备用。临用前，按上述配方比例，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1mL及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）1mL，混合均匀。加热溶解前，加入1.2%～1.5%琼脂可制成固体培养基。如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。3.2培养基的存放在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。4步骤4.1水样量的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。如未知水样中粪大肠菌的密度，就应按下表所列体积过滤水样，以得知水样的粪大肠杆菌密度。先估计出适合在滤膜上计数所应使用的体积，然后再取这个体积的1/10和10倍，分别过滤。理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠菌群菌落，总菌落数不得超过200个。使用的水样量可参考下表。接种量(mL）水样种类检测方法100501010.110-210-310-410-5较清洁的湖水滤膜法×××一般的江水滤膜法×××城市内的河水滤膜法×××城市原污水滤膜法×××4.2滤膜及滤器的灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂。也可用121℃灭菌10min，10min一到，迅速将蒸汽放出，这样可以尽量减少滤膜上凝集的水分。滤器、接液瓶和垫圈分别用纸包好，在使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30min。滤器灭菌也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。4.3过滤装置安装：以无菌操作把滤器装置依照下图装好。4.4过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器。将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。3.5培养：使用M−FC培养基。培养基含或不含琼脂，不含琼脂的培养基使用已用M-FC培养基饱和的无菌吸收垫。将滤过水样的滤膜置于琼脂或吸收垫表面。将培养皿紧密盖好后，置于能准确恒温于44.5℃±0.5℃的恒温培养箱或恒温水浴中，经24h±2h培养。若用恒温水浴培养，则需用防水胶带贴封每个平皿，将培养皿成叠封入防水塑料袋或容器内，浸没在44.5℃±0.5℃恒温水浴中。在培养时间内，装培养皿的塑料袋必须用重物坠于水面之下，以保持所需的严格温度。所有已制