操作流程

Western-Blot操作流程试剂配制（一）母液1.0mol/LTris·HClTris(MW121.14)30.29g蒸馏水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。PHHCl7.4约17ml7.5约16m7.6约15ml8.0约10ml1.74mg/ml(10mmol/L)PMSFPMSF0.174g异丙醇100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。0.2mol/LNaH2PO4NaH2PO4（MW119.98）12g蒸馏水至500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW358.14）71.6g蒸馏水至1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。10％SDSSDS10g蒸馏水至100ml50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g超纯水1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)45.43g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）Tris(MW121.14)15.14g超纯水200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。40％Acr/Bic（37.5：1）丙稀酰胺（Acr）37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g超纯水至100ml溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。20％Tween20Tween2020ml蒸馏水至100ml混匀后4℃保存。（二）使用液单去污剂裂解液（PMSF）：1mol/LTris·HCl（pH8.0）2.5mlNaCl0.438gTritonX-1000.5ml蒸馏水至50ml混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。（一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方：50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、1mMPMSF、1mMEDTA、1%Tritonx-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS。至于其中每个要加多少量那就自己去算吧，因为本人已经算好的配方表无意间弄丢了）0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）0.2mol/LNaH2PO419ml0.2mol/LNa2HPO481mlNaCl17g蒸馏水至2000ml（如果用TBST进行洗膜的话，其实PBS用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可，500ml的浓缩液不到50元，很方便）G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250100mg95％乙醇50ml磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。0.15mol/LNaClNaCl（MW58.44）0.877g蒸馏水至100ml高温灭菌后，室温保存。100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）BSA0.1g0.15mol/LNaCl1ml溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/LNaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。10％分离胶和4％浓缩校10％分离胶（两块胶，10ml）4％浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水4.85ml3.16ml40％Acr/Bic（37.5：1）2.5ml0.5ml1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5ml－0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）－1.26ml10％SDS100μl50μl10%AP（过硫酸胺）50μl25μlTEMED5μl5μl加TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）还原型5XSDS上样缓冲液0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39gSDS0.5g溴酚蓝0.025甘油2.5ml混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。电泳液缓冲液Tris（MW121.14）3.03g甘氨酸（MW75.07）18.77gSDS1g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）（可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）转移缓冲液甘氨酸（MW75.07）2.9gTris（MW121.14）5.8gSDS0.37g甲醇200ml蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）10X丽春红染液丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g蒸馏水至100ml使用时将其稀释10倍。TBS缓冲液1mol/LTris·HCl（pH7.5）10mlNaCl8.8g蒸馏水至1000ml（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）TBST缓冲液20％Tween201.65mlTBS700ml混匀后即可使用，最好现用现配。封闭液脱脂奶粉（国产，光明牌）5gTBST100ml最好现用现配。洗脱抗体缓冲液14.4mol/L2-Mercaptoethanol(β-巯基乙醇)700μl（通风厨里加）SDS2g0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）12.5ml超纯水至100ml配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。（可用可不用）显影液（5X）自来水（加热至50℃）375ml（以下药品加到温水中）米吐尔1.55g亚硫酸钠（无水）22.5g碳酸钠（无水）33.75g溴化钾20.95g补水至500ml配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）定影液自来水（50～60℃）700ml（以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸钠240g亚硫酸钠（无水）15g冰乙酸12.6ml硼酸7.5g钾明矾15g（水温冷至30℃以下时再加入）加水定容至1000ml，室温保存。（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）抗体用TBST稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便宜，可以多买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）。化学发光试剂分A和B两种试剂，有钱可以购买Amersham、Pierce或者SantaCruz的，没钱的话碧云天的ECL也能凑合。操作步骤（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于-20℃保存。（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100-200μl的裂解液，按照上述操作，直接用200μl裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）（2）组织中总蛋白的提取：1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2、加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。4、裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。2、弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。3、用枪洗干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。（二）蛋白含量的测定（1）制作标准曲线1、从-20℃取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。3、按下表在各管中加入各种试剂。0μg2.5μg5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg1mg/mlBSA－2.5μl5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/LNaCl100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μlG250考马斯亮蓝溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计上比色分析。（2）检测样品蛋白含量1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。4、取一管考马斯亮蓝加95μl0.15mol/LNaClNaCl溶液和5μl待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5μl样品含的蛋白量。（上述方法只是一家之言，可以自我变通，本人就不是按照上述方法进行的）（三）SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶）2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5