10微生物遗传变异和育种

第八章微生物的遗传变异与育种遗传与变异的概念•遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。•遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代将自身一整套遗传信息传递给下一代的行为和功能。特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；--是一种内在可能性或潜力。•表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;--是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。变异(variation):生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。饰变（modification）：指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是：细菌的变异现象•形态、结构变异•毒力变异•耐药性变异•菌落变异形态结构变异•3-6%食盐鼠疫耶氏菌多形态性陈旧培基物•青霉素、溶菌酶正常形态细菌L型变异抗体或补体(部分或完全失去胞壁)•特殊结构的变异42-43℃炭疽杆菌失去形成芽孢能力,毒性降低10-20天变形杆菌0.1%石炭酸迁徙生长（H）点状生长、单个菌落（O）鞭毛变异毒力变异•增强β棒状噬菌体白喉棒状杆菌获得白喉毒素•减弱胆汁、甘油、马铃薯培养基牛分枝杆菌卡介苗13年(230代)耐药性变异•细菌对某种抗菌药物有敏感变成耐药的变异称为耐药性变异。•金黄色葡萄球菌•有些细菌还同时耐受多种抗菌药物，即多重耐药性，甚至产生药物依赖性。含链霉素培基痢疾杆菌依链株长期培养菌落变异在陈旧培养基中长期培养光滑型菌落粗糙型菌落SR原因：失去LPS的特异多糖凡游离于原核生物核基因组之外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的双链DNA分子．分子量约为２—100×106D.携带1—100个基因,一个菌细胞可有一至数十个质粒。Structureofabacteriumhighlightingthebacterialplasmid.三、原核生物的质粒2质粒的特点：1、可以在细胞质中独立于染色体之外（即以游离状态）存在，也可以插入到染色体上以附加体(某些可以与染色体发生整合与脱离的质粒）的形式存在；2、在细胞分裂时，可以不依赖于细菌染色体而独立进行自我复制，也可以插入到细菌染色体中与染色体一道进行复制；3、质粒可以通过转化、转导或接合作用而由一个细胞转移到另一个细胞，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；4、质粒对于细胞生存并不是必要的。存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcuslactis、根癌土壤杆菌等制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法3质粒的种类：1、大肠杆菌的F因子2、细菌抗药质粒（R因子）3、大肠杆菌素质粒（Col因子）4、Ti质粒5、降解质粒6、毒性质粒4.1F–因子（fertilityfactor）：又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，含有与质粒复制和转移有关的许多基因和一些转座因子（可以整合到宿主核染色体上的一定部位）。决定性别（F+－雄性；F-－雌性）。tra基因编码性纤毛蛋白；IS2和IS3为插入序列；Tn1000为转座子。插入序列只携带与其转座相关的基因，编码特殊的酶和调节蛋白，不给与细菌表型特征，但其插入会影响读码。转座子携带有能赋予宿主某种遗传特性的基因。–R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性决定R因子（r-determinant）。–RTF为分子量约为11×106Dalton，控制质粒拷贝数及复制和转移。–抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106Dalton以上。其上带有各种抗生素的抗性基因。4.2R因子（resistencefactor）•产大肠杆菌素因子。•大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约4×104~8×104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。•凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。4.3Col因子（colicinogenicfactor）•即诱癌质粒。•存在于根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。•当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的T-DNA小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，合成正常植株所没有的冠瘿碱类，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。4.4Ti质粒（tumorinducingplasmid）农杆菌限制性酶内切及DNA连接外源基因DNA/CDNA转入培养的植物细胞插入新基因的DNA重建植物体表现出新性状的植株农杆菌Ti质粒转化植物的技术•Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。•降解质粒：具有分解多种特殊有机化合物能力的因子。如分解甲苯的TOL质粒。•毒性质粒：携带编码产生毒素基因的质粒，如苏云金杆菌中编码内毒素的质粒，Col质粒也是毒性质粒。第二节基因突变和诱变育种•基因突变（mutation）：生物体在外因或内因的作用下，遗传物质的结构或数量发生改变。•突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株。•野生型（wildtype）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株。依表型的改变分为：•营养缺陷型——因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。•抗性突变型——因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性。•条件致死突变型——突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型。•形态突变型——由突变引起的个体或菌落形态的变异。•抗原突变型——因突变而引起的抗原结构发生改变•产量突变型——通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。（一）基因突变的类型★按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（selectivemutant）：具有选择标记（如营养缺陷型、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。非选择性突变株（non-selectivemutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。•定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。•突变率为10–8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。•突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2×108个细胞时，平均发生一次突变的突变率也是10–8。（二）突变率•突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数•突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。•由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（backmutant或reversemutant）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。若干细菌某一性状的自发突变率•菌名突变性状突变率•E.coli抗T1噬菌体3×10–8•E.coli抗T3噬菌体1×10–7•E.coli不发酵乳糖1×10–10•E.coli抗紫外线1×10–5•Staphylococcusaureus抗青霉素1×10–7•S.aureus抗链霉素1×10–9•Salmonellatyphi抗25g/L链霉素1×10–6•Bacillusmegaterium抗异烟肼5×10–5（三）突变的特点不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变。（四）基因突变的自发性和不对应性的证明•在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。–一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种突变是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。–另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。–从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。平板影印培养试验（replicaplating）•1952年，J.Lederberg夫妇的论文《平板影印培养法和细菌突变株的间接选择》，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。•平板影印培养法，是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。因此，通过影印培养法，就可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变株。平板影印培养法在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。第三节细菌的基因转移和重组•结合（conjugation）：两个细菌通过性菌毛沟通，将质粒上的遗传物质从供体菌转移给受体菌的过程。转导（transduction）：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状。转化（transformation）：受体细胞从外界直接吸收来自供体细胞的遗传物质（DNA片段或质粒DNA），从而引起生物遗传性状的改变。带上宿主染色体的遗传因子•转化（transformation）：受体细胞从外界直接吸收来自供体细胞的遗传物质（DNA片段或质粒DNA），从而引起生物遗传性状的改变。•转化子：经转化后出现了供体性状的受体细胞。•转化因子：有转化活性的外来DNA片段。•感受态：细菌能从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。，交换重组感受态：促进自溶素的表达，使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶裸露出来，从而使其能与外源DNA结合并对DNA进行切割，只有一条链能与特异蛋白结合进入细胞。另一条链被核酸酶降解，产生的能量用于核酸链的进入。•转导（transduction）：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状。转导子：通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞。•转导噬菌体(转导颗粒）：携带供体部分遗传物质的噬菌体。仅含有供体DNA的称为完全缺陷噬菌体；同时含有供体DNA和噬菌体DNA的称为部分缺陷噬菌体。转导方式•普遍性转导：转导噬菌体可携带供体基因组中的任何一部分染色体片段，在感染受体时，所有转导基因都能以相同的频率转移，使受体获得这部