16SrRNA技术用于硝化过程中微生物种群结构分析初探李红岩

上编研究报告。27。165rRNA技术用于硝化过程中微生物种群结构分析初探李红岩刘新春杨清香杨敏(中科院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室,北京10。。85)摘要:在不排泥条件下利用膜生物反应器对高浓度无机氨氮废水进行硝化处理,当HRT减少至1h0以内时,开始出现氨氮和亚硝酸盐积累。DGGE分析发现,反应器内生物多样性随着运行时间的延长而增加,使得活性污泥中硝化菌相对比率下降。lFsH结果说明,iNtorbacterlasPp.不是系统内亚硝酸氧化的优势菌种。关键词:硝化膜生物反应器变性梯度凝胶电泳荧光原位杂交种群结构AnalysisofMicrobialCommunityMBRUsingRibosomalRNAinNitrifiC8tionAPProachesLlHongyanLIUXinehunYANGQingxiangYANGMin(StateKeyLaboratoryofEnvironnrentalAquatieChemistry,ResearehCenterforEeo一EnvironmentalSeienees,ChineseAeademyofSeienees,Beiiing100085)Abstraet:Anrembranebio一reaetorwasusedtotreathighammoniumstrengthinorganiewastewaterwithoutdisehargeofexeesssludge.AeeumulationofammoniumandnitriteappearedwhenHRTwasdeereasedto10h.Denaturinggradientgeleleetrophoresis(DGGE)analysisin-dieatedtheinereaseofbiodiversitywithoperation士ime,whiehresultedinthedeereaseoftheratioofnitrifiersinaetivatedsludge.Fluoreseeneeinsituhybridization(FISH)analysisdemonstratedthatammoniaoxidizersweremainlyeomposedofbeta一subelassofproteobaeteria,andnitrobaeteriaspp.wasnotthedominatingnitrite一oxidizerspeeies.Keywords:Nitrifieation,Membranebio一reaetor,DGGE,FISH,Communitystrueture以硝化和反硝化为主要反应步骤的生物脱氮是废水脱氮中应用最广的方法之一。然而,作为主体单元的硝化细菌生长缓慢,对环境因素(如pH,DO,温度等)比较敏感,因此硝化过程被认为是建立稳定高效脱氮系统的关键。近年来出现的膜生物反应器是一种生物处理技术和膜分离技术相结合的新工艺,膜的截留作用以及长的污泥停留时间有利于维持稳定的硝化功能。硝化细菌包括氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌两大类。在水处理过程中两类硝化细菌相互结合,常常以一种团块结构存在,而传统的培养方式(如MPN法,平板技术)不能对活性污泥巾硝化菌的地位给予确切描述。·28·微生物生态学研究进展—第五届微生物生态学术研讨会论文集以165rRNA技术为基础的荧光原位杂交(FISH)技术及变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术等分子生物学方法为分析微生物群落结构及其在时间或空间上的动态变化提供了有效手段l[,幻。本研究尝试着结合这两种技术分析膜生物反应器在处理高浓度氨氮废水过程中的生物群落变化,为阐明生物群落结构与工艺运行状态之间的联系提供依据。1实验装置实验装置如图1所示。本研究采用的一体式膜生物反应器实验装置由生物曝气池及中空}}}一一}}}}}}}}}}}}}}爪爪}}}}}!!!!!!!!!!!!!!!!!—}}}}}lll000................................--~司司司一一一一一一目-~~~~~刁刁刁..........一.~~~叫叫叫筐筐筐筐筐摹摹rrrrrrrrr1...lllllllll卜=一.一闷闷llllllllliii图1一体式膜生物反应器实验装置示意图1进水泵;2曝气泵;3膜组件;4水位控制仪;5pH自动调节泵;6真空压力表;7出水泵;8时间控制器,9出水;10进水池;n碱液池纤维膜分离单元组成。反应器有效容积为18.SL,膜下用穿孔曝气管间歇曝气,膜孔径为0.4拌m。人工配制无机氨氮包括NH峨HC03,NaHCO。及微量元素。自动加药泵进行pH自动调节。整个实验均在20℃恒温室内进行。2实验结果与讨论.21运行效果在进水氨氮浓度为500mg/L,无排泥的条件下,进行硝化反应。处理过程中,不断提高水力负荷,使HRT从30h逐步缩短至h5(每个条件下的运行时间分别为30h,30d;20h,90d;15h,3od;10h,30d;7h,4od;sh,40d)。污泥浓度变化如图2所示。污泥浓度在第二周期的变化最为明显,从开始时的4500mg/L增至最后的gO00mg/L,随后几个周期生物生长基本达到平衡,在10000一11000mg/L范围内变动。硝化效果见表1。从表1中可以看出,在水力停留时表1不同HRT时膜生物反应器内硝化效果时间3oh20h15h10h7hshNH不一N(进水)NH了一N(出水)NOZ一NN03一N474.4士17.90.128士0.10452.8士22.35012士23.80.5士0.40481.8士27.3451.6士498O`39士0.270501.5士23.9491.4士31.49.2士7.44.2士0.8400.4士26.3474.0士64.363.8士33.614.0士6.9375.1士49.3496.1士49.997.8士23.4140.2士60.2267.7士65.7间缩短至10h时[容积负荷为1.kZgNH才一Nd/.L,污泥负荷2.1k6gNH或一N(/d·kg上编研究报告55)],膜生物反应器仍能进行完全硝化,出水氨氮平均为9.Zmg/L左右,亚硝酸氮也未见积累,平均浓度为4.Zmg/L。但若继续缩短水力停留时间升高负荷出水氨氮和亚硝酸氮均发生积累,硝化不完全。已有报道证明,操作条件的改变会对硝化细菌结构、活性产生明显影响3[]。为阐明膜生物反应器的硝化过程中,种群结构与操作运行之间的关系,本实验利用分子生物学技术进行剖析。.22微生态解析2.2.1变性梯度凝胶电泳(DGGE)如图2所示,随运行时间的延长各条泳道内的条带数呈现逐渐增加的变化,特别是在前3个周期内条带数的变化最为显著。图2(b)可以看出以条带6作为标准,各周期的相似性也成连续变化。异源双链核酸分子(两个相似但不相同而联结的条带)以及一种细菌产生两条以上rDNA序列这种情况在细菌中比较少见,所以通常假设一条带代表一个种,同一谱图中的对应条带密度可代表此种的丰度。那么图2结果表明,随着运行时间的延长,由于膜的截留和浓缩作用膜生物反应器内的生物种类不断增加。一些在运行初期存在的优势种(主要为硝化菌)并没有随着运行时间的延长和运行条件的恶化而消失或减少,表明膜生物反应器确实对硝化菌存在保护作用。而一些原来没有或很少的菌种(如条带10,12,13,15,17和19等)随着运行时间的延长不断增加,有些最终成为优势种。目前,各条带的测序结果还未得到,但可以推测,后来增加的菌大多是以菌残骸和分泌物为底物的异养菌。这一结果表明,虽然反应器内污泥浓度随着运行时间的延长而不断增加(图3),硝化菌在其中的比率却呈下降趋势,致使污泥的比硝化活性降低。反应器不能维持继续升高的水力负荷,达到完全硝化。一3·4,56,78910:11;13,15全16;18于21奋23一24:26一2728·29`;宁一一、、甲`立一一-一、一未!十11ì十.+十十王工十!十一一r一一一一一一一一一一一23456劝晌胭娜勿山阅.口睁.口目..曰翻翻峨如晰湘暇二二二一ù二一一ù三一一二兮忠名署翻劝...__加_一白曰目.二琴释一月...`.`....曰山硕......~一妇`侧一份一叙一之``云.日二二丫土!l十|丰.士十丰土工斗土工,一l二·丫:·十l二`士一早二一ǔ牛=牛二6543100.0%83.7%77.3%7721.3%66.7%51.4%(a)图2反应器内生物群体DGGE谱(a)f减;GE谱图;b()各条带示意图(两侧为带序号,下侧为相似百分数).130h;220h;315h;410h;57h;6sh·30·微生物生态学研究进展—第五届微生物生态学术研讨会论文集_1丫`丫2丫3丫`丫5丫6口12卜1111_1000\1111~卜。。,10.灿111_I000r一O甘l~,卜!.pdOU!11划11`00一1111孟只l二、.11}l怎br夕甲】111念100}}1}}“3}!}}}IO巴吕二`·…卜.吕·J50100150200250日期图3污泥浓度随着运行时间的变化DGGE为分析环境样品的生物结构提供了直观而准确的结果,但要确定生物种属的失与增需进行测序或杂交定位,而且不能进行定量分析(例如,硝化不完全可能由于某些硝化细菌种量的变化)。在定量描述生物结构方面,荧光原位杂交(IFSH)更有优势川。2.2.2荧光原位杂交荧光原位杂交(IFSH)就是用已标记过的DNA探针与完整细胞中的核酸序列结合,在特定波段激发后通过荧光显微镜捕捉信息进行定量与定性检测的一种技术。图4(b)表明,系统中存在大量Nsol90及Nso1225(未列出)对应的氨氧化细菌。虽然传统观点认为,iNtorbacte-irasPP.为生物硝化体系中亚硝酸盐氧化细菌中的优势菌,但在本实验中没有检测出来,如图4a()所示。这一现象与其他一些研究报告一致2[]。(a)(b)图4NIT3探针杂交(a)和Nsolgo探针杂交(b)本实验也利用探针EUB338与DAIP试剂的双染对真细菌与全菌数的比例进行了分析(图5所示为1h0HRT的EUB/DAIP复染图例)。实验结果表明,EUB/DAIP为33.5%。为图5EUB探针与DAIP试剂复染上编研究报告·31.解释种群动态变化与硝化效果的关系,不同种硝化菌所占比率的量化实验正在进行。3结论(1)长期无排泥运行明显改变了膜生物反应器中污泥的生物结构,使硝化菌在污泥中的比例下降。(2)荧光原位杂交则有针对性地从量化效果分析硝化细菌动态变化。目前结果表明,氨氧化细菌可以利用Nsol90及Nso1225探针进行分析,但用NIT3探针没有检测出相应的细菌,表明NitrobacteiraSPP.可能不是亚硝酸盐氧化细菌的优势菌种。参考文献[l〕SatoshiOkabeetal.Insituanalysisofnitrifyingbiofilmsasdeterminedbyinsituhybridizationandtheuseofmieroeleetrodes.月妙1andEnvironMicorbio,1999,65(7):3182一3191仁2〕StefanJuretsehkoetal.Combinedmoleeularandeonventionalanalysesofnirrifyingbaeteriumdiversityinaetivatedsludge:NitrosoeoeeusmobbilisandNitrospira一likebaeteriaasdominantpopulations.月户户1andEnviorn材icorbio,1998,64(8):3042一3051〔3〕ReginaNogueiraetal.Nitrifyingandheterotrophiepopulationdynamiesinbiofilmreaetors:effeetsofhy-draulieretentiontimeandthepreseneeoforganieear