PCRDGGE研究Carrousel2000氧化沟工艺

2011-10-25DOI:10.3724/SP.J.1145.2011.00727应用与环境生物学报2011，17(5):727~730ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687XPCR-DGGE（Polymerasechainreaction-denaturegradientgelelectrophoresis）作为一种指纹分析技术，具有可重复、快速、准确和操作简便等特点，近年来在分子微生态研究方面得到了广泛的应用[1~5].对于城市污水处理中微生物的研究，以往人们多是在实验室中模拟研究[6~7]，或者在实际工程调试过程中采用镜检或者对常规水质指标的调查进而作出经验性的判断，准确性差且结果滞后.本研究应用分子生物学技术对实际工艺调试过程进行跟踪研究[8~9].微孔曝气型Carrousel2000氧化沟工艺是一种先进、稳定、高效的以脱氮除磷为特征的生物处理工艺，研究其在调试过程中微生物种群的变化情况对新工艺的开发和研究具有一定的参考价值.1工程背景郑州市五龙口污水处理厂一期工程采用Carrousel2000氧化沟工艺.其设计处理能力为10×104m3/d，工艺流程见图1.PCR-DGGE研究Carrousel2000氧化沟工艺调试过程中的微生物多样性*许春红1刘永德1赵继红1,2**（1河南工业大学化学化工学院郑州450001）（2郑州轻工业学院郑州450002）ApplicationofPCR-DGGEtoStudyMicrobialDiversityDuringtheOperatingofCarrousel2000OxidationDitch*XUChunhong1,LIUYongde1&ZHAOJihong1,2**(1InstituteofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450001,China)(2ZhengzhouUniversityofLightIndustry,Zhengzhou450002,China)Abstract�ore�ealmicro�ialdi�ersityo��aero�icacti�atedsludgeinCarrousel2000o�idationditch,thesludgeinthestartup�ore�ealmicro�ialdi�ersityo��aero�icacti�atedsludgeinCarrousel2000o�idationditch,thesludgeinthestartupoftheoxidationditchwassampledandtheirgenomicDNAwasextracteddirectlyandpurified,thenthe16SrDNAgenes(V3region)wereampli��ied,anddenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)wasusedtodetectmicro�ialdi�ersityo��thesludgeinoxidationditchstarting-up.TheDGGEprofilesrevealedthatmicrobialpopulationintheactivatedsludgewas�eryrich.Wastewaterquality�ariationatinitialstagehado��iouse����ectsonthemicro�ialpopulationino�idationditchtilltwomonthslater.Butthemicro�ialpopulationininoculatedacti�atedsludgecouldadaptquicklytostructureandhydraulicpropertieso��thenewo�idationditchprocess.�heoperationstarted��romApril,andthemaximalsimilaritycoefficientofthemicro�ialpopulationino�idationditchwas68.9%inApril,70.8%��romMaytoJune,and73.0%inAugust,respecti�ely.�hisshowedthatthesimilaritycoefficientofthemicrobialpopulationincreasedgraduallyandremainedstable.Duringthisprocess,theremo�ale����ecti�enesso��CODandammonianitrogenalsoincreasedgraduallyandtendedtosta�le.�hecomprehensi�eanalysisindicatedthatitwastakena�outtwomonths��ordomesticatingtheaero�icacti�atedsludgeinCarrousel2000o�idationditch.Fig4,�a�4,Re��12KeywordsCarrousel2000o�idationditch;aero�icacti�atedsludge;PolymeraseChainReaction-DenatureGradientGelElectrophoresis(PCR-DGGE);micro�ialdi�ersityCLCX172:Q938摘要收集Carrousel2000型氧化沟工艺启动过程中活性污泥样品，直接提取微生物的基因组DNA并纯化，然后对细菌16SrDNA的V3高变区进行PCR扩增和DGGE分离，通过比较DGGE图谱的相似性来研究工艺调试过程中微生物种群的变化情况.研究表明，活性污泥中具有非常丰富的微生物种群.调试初期水质波动对氧化沟中微生物种群的影响非常明显，但接种的成熟活性污泥中微生物种群能够很快适应新型氧化沟工艺的结构及水力特性.调试从4月开始，4月氧化沟中微生物种群相似性Cs最大值为68.9%，5~6月Cs最大值为70.8%，8月Cs最大值为73.0%，可见氧化沟中微生物种群相似性逐渐增加，直至稳定.在此过程中，系统对COD、氨氮的处理效果同步提高并趋于稳定.综合分析好氧活性污泥在氧化沟中驯化期为2个月.图4表4参12关键词Carrousel2000氧化沟；好氧活性污泥；PCR-DGGE；微生物种群多样性CLCX172:Q938收稿日期：2010-10-29接受日期：2010-11-15*河南省杰出青年科学基金（No.0512001500）和河南省重大公益招标项目（No.101100910300）资助Supported�ytheScienceFoundationo��Henan,China��orDistinguishedYouthScholars(No.0512001500)andtheKeyCommonwealProjecto��Henan(No.101100910300)**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:[e-mail])72817卷应用与环境生物学报ChinJApplEnvironBiol2材料与方法2.1材����2.1.1活性污泥采集污活性泥取自正在调试的氧化沟工艺，每隔一周左右取一次样，具体水质指标以实际监测结果为准.每次取样前先将10mL离心管灭菌，取样时用取样点的活性污泥混合液润洗，所取混合液在取样杯中静置5min左右，倒掉上清液后迅速装入离心管，放入冰盒中冷藏并带回实验室.2.1.2仪器及设备低温冷冻离心机，电泳仪（北京六一），紫外－可见分光光度计，PCR扩增仪（德国Biometra），凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad），基因突变检测系统（美国Bio-Rad）.2.2方����2.2.1活性污泥样品预处理及总DNA提取参照高平平等的方法[10]，对污泥样品进行预处理，解絮凝，去除部分腐殖质.采用修改后的C�AB法从污泥样品中提取基因组DNA.参考Ogram等的方法[11~13]，运用SDS裂解和�ead-�eating均质相结合的方法对样品进行裂解.1）SDS裂解细胞：将沉淀悬浮于1mL抽提液（100mmol/LED�A，100mmol/L�ris，200mmol/LNaCl，2%C�AB，1%PVP，pH8.0）中，加入2颗灭菌玻璃珠（d：2~3mm），充分漩涡5min后，加入2mLSDS�u����er（10%，pH8.0），漩涡混匀后放置冰浴中20min.2）消化蛋白：加入10µL蛋白酶K（20mg/mL），37℃温�温�1h.3）基因组DNA的抽提：将上述处理液以10000r/min，4℃离心离心5min后收集上清液，加入1:1的重蒸酚抽提上清液，12000r/min，4℃离心离心5min，取上清后加入1:1的�ris饱和氯仿抽提，10000r/min，4℃离离心5min，取上清后加入0.6倍体积的预冷的异丙醇放置在－20℃冰�中冰�中30min，或过夜沉淀DNA.12000r/min，离心5min，用双蒸水溶解沉淀即为所得的基因组DNA粗提液.样品在－20℃冰�冻�冰�冻�.2.2.2纯�化化化采用上海生工的柱式DNA胶回收试剂盒（NO.SK1132）进行纯化.测定DNA样品在260nm和280nm的吸光度，计算A260nm/A280nm的比值确定样品纯度，比值应该大于1.75，否则重新纯化.2.2.3PCR扩增扩增反应参照R.MaaritNiemi等的方法[14].16SrDNA基因V3区的引物：选用对大多数细菌与古菌的16SrDNA基因V3区具有特异性的引物对：F357GC与R518.各自的序列为：F357：（5`-CC�ACGGGAGGCAGCAG-3`），R518：（5`-A��ACCGCGGC�GC�GG-3`），GC发卡结构：（5`-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3`）.扩增反应体系为50μL，组成如下：1μL的DNA模板、0.5μmol/L每种引物、200μmol/LdNTP（每种10mmol/L）、1×PCR�u����er（withoutMg2+）、1.5mmol/LgCl2、2.5UHeatstart�aq酶，用适量无菌超纯水补足50μL.采用降落式PCR扩增，可以提高样品的扩增特异性，降低DGGE分析的误差.扩增条件如下：94℃预变性预变性5min；94℃变性变性45s，65~55℃����45s，72℃����60s，前20个循环每个循环��温度降低0.5℃，后，后10个循环��温度为55℃；；最后72℃����120s.扩增在梯度PCR仪上进行，PCR产物用1.7%琼脂糖凝胶电泳进行分析检测，DNAMarker选用pUC19（上海生工），紫外成像保�结果.2.2.4DGGE采用Bio-rad公司生产的DGGE变性检测系统对PCR产物进行电泳.聚丙烯酰胺变性梯度胶浓度为10%，变性梯度为35%~55%，上样量为30μL的PCR产物.其运行条件是：温度62℃，电压为120Ⅴ，，1×�AE�u����er中电泳6h，电泳完成后，用SYBRGreen1核酸染色液染色45min，用去离子水漂洗两次，立即在紫外照相仪上观察并照相.所得图像用BIO-RADQUAN�I�YONE4.3.0软件进行处理.DGGE条带图案相似性由系统依据戴斯系数Cs（Dicecoe����icient）按照有关方法自动计算绘出系统树图.Cs=2j/(a+b)，j是样品A和B的共有条带，a和b分别是样品A和B中各自的条带数.戴斯系数的范围是从0（没有相同条带）到1（所有的条带都相同），也可用百分数表示.3结果与分析3.14月份实验结果4月份共采样5次，其DGGE图谱见图2，5~6月份取样6