PH对微生物的影响

*pH对微生物的影响陈燕飞(太原师范学院生物系,山西太原030012)1摘要2溶液的酸碱度通常以氢离子浓度的负对数(即pH)来表示,培养基或环境中的pH对于微生物的生命活动有着密切的联系外,它的影响也是多方面的,因为环境的pH会影响到细胞膜所带的电荷,从而引起细胞对营养物质吸收状况的改变.此外,还可以通过改变培养基中的有机化合物的离子化程度,而对细胞施加间接的影响,改变某些化合物分子,进入细胞的状态,从而促进或抑制微生物的生长.微生物通常可以在一个较宽的pH范围内生长,但都有一个最适pH,在最适pH范围内酶活性最高,如果其他条件适合,微生物的生长率也最高.1关键词2微生物;p长H;生1文章编号2167222027(2009)03201212041中图分类号2Q9361文献标识码2A微生物学作为一门学科,是在19世纪中期才发展起来的.这是因为当时在欧洲一些国家中,占有重要经济地位的酿酒工业和蚕丝业发生了酒变质和蚕病危害等问题,促进了微生物的研究,以法国科学家Pasteur和德国科学家Koch为代表,他们研究了微生物的生理活动,并与生产和预防疾病联系起来,为微生物学奠定理论和技术基础[1].现在人们对微生物的开发利用,不仅仅限于食品和医学方面,而是已经扩展到能源工业!冶金工业!化学工业!农业!林业!牧业以及环境保护等许多国民经济和人民生活的重要领域[2].在能源方面,提高石油产量,可利用微生物或微生物的某些产品进行三次采油;在冶金方面,利用微生物浸出法,从贫矿或尾矿的矿石中溶取铜!铀!锰!锌!锑等,是一项颇有成效的技术[3];在化工方面,利用微生物生产各种醇类!有机酸!多糖!脂肪!氨基酸!维生素!抗生素!激素!和酶制剂等;在环保方面,利用微生物的降解作用处理废水!废物,消除污染!保护环境[4];在农业方面,微生物的利用更加广泛,尤其是生物固氮的研究,将来有可能使人类模拟生物固氮生产化肥,或利用微生物固氮基因让农作物获得固氮能力成为现实,这将会给农业带来一次革命性的变化[5].微生物与人类息息相关,它对人类的假定贡献和无法估量的开发潜力,为我们展开了广阔的应用前景,所以研究微生物的生命活动有着重要意义,其中pH与微生物的生命活动有密切联系[6].为了更好地为人类的生活和健康做出更大的贡献,将进一步探究pH对微生物的影响.1基本原理pH对微生物的生命活动有很大的影响,主要通过几个方面实现:一是使蛋白质!`核酸等生物大分子所带电荷发生变化,从而影响其生物活性;二是引起细胞膜电荷变化,导致微生物细胞吸收营养物质能力改变;其三是改变环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性.不同微生物对pH条件的要求各不相同,它们只能在一定的pH范围内生长,这个pH范围有宽!有窄,而其生长最适pH常限于一个较窄的范围,对pH条件的不同要求在一定程度上反映出微生物对环境的适应能力.本实验选用大肠杆菌!金黄色葡萄球菌!酿酒酵母,分别在pH为3!4!7!9的培养基中培养,用比浊法测定菌液浓度[7].比浊法原理是在一定范围内,菌悬液中细胞的浓度与混浊度成正比,即与光密度成正比,菌越多,光密度越大.因此用分光光度计,在一定波长下,测定菌悬液的光密度,以光密度(即OD值)表示菌量.2器材与试剂2.1菌种*收稿日期:2009204217作者简介:陈燕飞(19712),女,山西万荣人,硕士研究生,太原师范学院生物系副教授,主要从事微生物与免疫研究.大肠杆菌!金黄色葡萄球菌!酿酒酵母菌种各一支.2.2溶液或试剂无菌生理盐水!牛肉膏!蛋白胨!NaCl!0.1mol/L的HCl和NaOH溶液.2.3仪器或其他用品酸度计!酒精灯!高压灭菌锅!分光光度计!天平!试管!无菌吸管等.2.4培养基的配置本实验用牛肉膏蛋白胨培养基[8].其配方如下:牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000mL1)称量按培养基的配方比例依次准确的称取牛肉膏!蛋白胨!NaCl放入烧杯中.2)溶化在上述烧杯中先加入少于所需的水量,用玻璃棒搅匀,然后在石棉网上加热使其溶解,待药品完全溶解后,补充水到所需的体积.3)调pH取配好的培养基各50ml于四个小烧杯中.用酸度计分别调其pH为3!5!7!9.4)分装取pH为3的培养基各5mL于11!21!31号试管内;取pH为5的培养基各5mL于12!22!32号试管内;取pH为7的培养基各5mL于13!23!33号试管内;取pH为9的培养基各5mL于14!24!34号试管内.5)加塞培养基分装完毕后,在试管口塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基而造成污染,并保证有良好的通气性能.6)包扎加塞后,将全部试管用麻绳捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以阻止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳捆好.7)灭菌将上述培养基以0.103MPa,121e,20min高压蒸汽灭菌.用相同的方法配置pH为3!5!7!9的固体培养基.3方法3.1液体培养基法a.大肠杆菌!金黄色葡萄球菌!酿酒酵母菌悬液的制备.无菌操作吸取适量生理盐水于菌种试管内,用接种针将菌苔从上向下刮取适量制成菌悬液,并用分光光度计测定其OD600nm值均为0.05.b.无菌操作分别吸取0.1mL大肠杆菌菌悬液于11!12!13!14号试管内;无菌操作分别吸取0.1mL金黄色葡萄球菌菌悬液于21!22!32!42号试管内.无菌操作分别吸取0.1mL酿酒酵母菌悬液于31!32!33!34号试管内.c.将11!12!13!14!21!22!23!24号八支试管置于37e培养箱培养24~48h,将31!32!33!34号四支试管置于28e培养箱培养48~72h.d.培养时间到后,将上述试管取出,利用分光光度计测定培养物的OD600nm值.3.2固体培养基法122太原师范学院学报(自然科学版)第8卷a.接种前半小时打开紫外灯.b.在牛肉膏蛋白胨培养皿上用记号笔标明待接种的菌种名称.c.点燃酒精灯.d.将大肠杆菌菌种试管握在左手中,使试管底部放在手掌内,斜面向上成水平状态,在火焰边用右手松动试管塞以利于接种时拔出.e.右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌,在火焰边用右手的手掌边缘和小指!小指和无名指分别夹持棉塞将其取出,并迅速灼烧管口.f.将灭菌的接种环伸入菌种试管内,先将环接触试管内壁,使接种环的温度下降,达到冷却的目的,然后再挑取少许菌苔.将接种环退出菌种试管,迅速在不同pH的培养基上画线.g.用同样的方法将金黄色葡萄球菌!酿酒酵母菌种接种在不同pH的培养基上.h.将接种好的培养基放在37e培养箱内培养.注意事项:1)配置为3的固体培养基时应将培养基成分和琼脂成分分开灭菌后再混合.2)吸菌液时一定要将其吹打均匀,保证各管中接入的菌液浓度一致.4结果与分析4.1结果4.1.1在波长为600nm时所测的各支试管的光密度(即OD值)见表1.表1在波长为600nm时所测的各支试管的光密度(即OD值)Table1TheOD600valuesofalltest2tubes菌名pH=3pH=5pH=7pH=9大肠杆菌0.1051.7001.9271.240金黄色葡萄球菌0.1131.6281.8681.234酿酒酵母0.3351.8451.6291.1294.1.2在不同pH条件下大肠杆菌!酿酒酵母!金黄色葡萄球菌的生长情况见图1.pH=3pH=5pH=7pH=9图1在不同pH条件下大肠杆菌!酿酒酵母!金黄色葡萄球菌的生长情况Fig.1Thegrowthofecoli,saccharomvcescerevisiae,staphylococcusaureusunderthedifferentpHcondition(从左至右依次为:大肠杆菌!酿酒酵母!金黄色葡萄球菌)123第3期陈燕飞:pH对微生物的影响4.2分析H+,OH-是所有离子中最容易波动的,所以他们浓度的微小变化都会产生颇大的影响,控制培养基初始pH值是非常重要的.从试验结果可以看出,在pH为7的条件下,它们生长都很好,但是酿酒酵母喜欢更低的pH环境.pH通过影响细胞质膜的透性!膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收,从而影响微生物的生长速率.质子是一种唯一不带电子的阳离子,它在溶液里能迅速地与水结合成水和氢离子.在偏碱性条件下,OH-占优势,水和氢离子和OH-对营养物质的溶解度和离解状态!细胞表面电荷平衡和细胞的胶体性质等方面均会产生重大影响.在酸性条件下,H+可以与营养物质结合,并能从可交换的结合物或细胞表面置换出阳离子,从而影响细胞结构的稳定性.5讨论尽管微生物通常可在一个较宽pH范围内生长,并且远离它们的最适pH,但它们对pH变化的耐受性也有一定限度.细胞质中pH突然变化会破坏质膜!抑制酶活性及影响膜运输蛋白的功能,从而对微生物造成损伤,环境中pH的变化会改变营养物质分子的电离状态,降低它们被微生物利用的有效性[9].虽然微生物能够生长的pH值范围比较广泛,但细胞内部的pH值却相对稳定,一般都接近中性.这是因为细胞内部的DNA!ATP等对酸性敏感,而RNA和磷脂等对碱性敏感,所以微生物细胞具有控制氢离子进出细胞的能力,维持细胞内环境中性[10].每种微生物都有其最适pH和一定的pH范围,在最适范围内酶活性最高,如果其他条件适合,微生物的生长率也最高.随着环境pH值的不断变化,使得微生物继续生长受阻,当超过最低或最高pH值时微生物就死亡[11].同一种微生物由于培养液pH值的不同,可能积累不同的代谢产物.在不同的发酵阶段,微生物对pH的要求也有差异.如酵母菌生长的最适pH为5左右,并进行乙醇发酵,不产生甘油和醋酸;如果使pH高于8时,发酵产物除乙醇外还有甘油和醋酸.因此,在发酵过程中,根据不同的目的常采用变动pH的方法,以提高生产效率[12].此外,还可利用微生物对pH的要求不同,促进有益微生物的生长或控制杂菌的污染.微生物在低于最低pH和高于最高pH的环境中都不能生长,所以强酸或强碱具有杀菌作用[13].一些无机酸如硫酸!盐酸等杀菌力虽强,但腐蚀性太大,不适于作杀菌剂,而某些有机酸如苯甲酸等可以作为防腐剂[14],在面包等食品中添加丙酸也可以防霉,酸菜!饲料青储则是利用乳酸菌发酵生产省的乳酸抑制腐败行为生物的生长,使之得以长久保存[15].强碱也可以用作杀菌剂,但它们毒性广,其用途局限于对排泄物及仓库!棚舍等环境的消毒.参考文献:[1]闵航.微生物学[M].杭州:浙江大学出版社,2005:1442145[2]周德庆.微生物学教程[M].第2版.北京:高等教育出版社,2005:1642166[3]杨苏声,周俊初.微生物学[M].北京:科学出版社,2004:129[4]张青,萝菁萍.微生物学[M].北京:科学出版社,2005:1442146[5]武汉大学,复旦大学生物系微生物学教研室.微生物学[M].第2版.北京:高等教育出版社,1987:2522254[6]沈萍.微生物学[M].北京:高等教育出版社,2000:1442145[7]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M].第3版.北京:高等教育出版社,1999:50254;63266;1082109[8]张文怡.微生物学[M].北京:高等教育出版社,2005:93294[9]潭洪治.微生物学[M].北京:高等教育出版社,1988:128[10]诸葛健,李华钟.微生物学[M].北京:科学出版社,2004:2852286[11]Prescott,L.M.微生物学[M].第5版..沈萍,译.北京:高等教育出版社,2003:1252126[12]黄秀梨.微生物学[M].第2版.北京:高等教育出版社,2003:1502151[13]杨颐康.微生物学[M].北京:高等教育出版社,1986:156[14]路福平.微生物学[M].北京:中国轻工业出版社,2005:1712173[15]钱存柔,黄仪秀.微生物学实验教程[M].北京:北京大学出版社,1999:10321081