UASB反应器中产甲烷菌对温度胁迫的响应

中国环境科学2016,36(4)：1082~1086ChinaEnvironmentalScienceUASB反应器中产甲烷菌对温度胁迫的响应张立国1,班巧英1*,李建政2(1.山西大学环境与资源学院,山西太原030006；2.哈尔滨工业大学市政与环境工程学院,黑龙江哈尔滨150090)摘要：采用间歇培养方式探讨了升流式厌氧污泥床(UASB)反应器中不同营养类型产甲烷菌对温度胁迫的响应规律.研究结果表明,产甲烷螺旋菌(Methanospirillum)是该反应器的主要氢营养型产甲烷菌,而主要乙酸营养型产甲烷菌为产甲烷丝状菌(Methanosaeta).在35℃条件下,氢营养型和乙酸营养型产甲烷菌的累计甲烷产量分别为24.7,11.7mL,而最大产甲烷速率分别为0.74,0.18mL/h.当温度从35℃分别降低至30,25,20,15℃时,导致氢营养型产甲烷菌的累计产甲烷量分别减少了14.2%,34.0%,47.0%,57.5%,而乙酸营养型产甲烷菌的累计产甲烷量分别减少了5.1%,23.9%,45.3%,95.7%.由此可见,在20~30℃时氢营养型产甲烷菌对温度胁迫更加敏感,而在15℃以下时乙酸营养营养型产甲烷菌对温度胁迫更加敏感.关键词：UASB反应器；产甲烷菌；温度胁迫；产甲烷量中图分类号：X703.5文献标识码：A文章编号：1000-6923(2016)04-1082-05ResponseofmethanogensontemperaturestressinanUASBreactor.ZHANGLi-guo1,BANQiao-ying1*,LIJian-zheng2(1.CollegeofEnvironmentandResource,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China；2.SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China).ChinaEnvironmentalScience,2016,36(4)：1082~1086Abstract：Theeffectsoftemperaturestressondifferentnutritiontypemethanogensinanupflowedanaerobicsludgeblanket(UASB)reactorwasinvestigatedbybatchculture.TheresultsshowedthatthedominanthydrogenotrophicandacetotrophicmethanogensinthisreactorwereMethanospirillumandMethanosaeta,respectively.Under35℃condition,theaccumulativemethaneproductionfromhydrogenotrophicandacetotrophicmethanogenswere24.7and11.7mL,separately.Andthemaximummethaneproductionrate(Rmax)were0.74and0.18mL/h,respectively.Temperaturedecreases,from35℃to30,25,20,15℃,resultedinaccumulativemethaneproductionsfromhydrogenotrophicmethanogensweredecreasedby14.2%,34.0%,47.0%,57.5%,respectively.Whilethosefromacetotrophicmethanogenswerereducedby5.1%,23.9%,45.3%,95.7%,separately.Theseresultsindicatedthathydrogenotrophicmethanogensaremoresensitivetotemperaturetressat20~30℃,whileacetotrophicmethanogensaremoresensitiveat≤15℃.Keywords：UASBreactor；methanogens；temperaturestress；methaneproduction有机物厌氧生物处理是在一系列微生物的协同代谢作用下完成的,包括水解发酵菌群,产氢产乙酸菌,同型产乙酸菌和产甲烷菌[1-3].其中,产甲烷菌位于食物链的最末端,在产甲烷系统中占有独特的生态位[4].由于产甲烷菌只能利用H2/CO2,乙酸,甲酸,甲胺等简单的底物进行生长代谢,且增殖缓慢,对环境因子变化亦较敏感,因此通常被认为是厌氧生物处理过程的限速步骤[5-6].温度是厌氧微生物重要生态因子之一,它不仅能够影响微生物的生长速率,同时可能会改变微生物的活性、丰富度等[7-8].另外,温度变化可能会引起系统pH值下降和游离氨浓度的增加,进而影响水解,产酸发酵和产甲烷效率,最终影响到厌氧生物处理反应器效能及其稳定性[9-10].目前,关于温度变化对厌氧反应器中不同营养型产甲烷菌活性影响的报道较少,本研究考察了产甲烷菌群对温度胁迫的响应规律,为厌氧生物处理反应器运行调控提供参考.收稿日期：2015-09-18基金项目：国家自然科学基金项目(51508316);山西省基础研究项目(2015021136,2015021134)*责任作者,讲师,[e-mail]4期张立国等：UASB反应器中产甲烷菌对温度胁迫的响应10831材料与方法1.1接种污泥接种污泥取自本实验室正在运行的升流式厌氧污泥床反应器(UASB),该反应器长期处理丙酸合成废水(以丙酸为唯一碳源).UASB的运行情况,温度35℃,水力停留时间(HRT)10h,进水COD3000mg/L,比COD去除率和比甲烷生成率分别为1.4kgCOD/(kgVSS·d)和285.3LCH4/(kgCODremoved·d).1.2静态摇瓶试验静态摇瓶试验采用间歇培养方式进行,实验容器为150mL血清瓶.每个血清瓶中加入10mLUASB反应器中的厌氧颗粒污泥(MLVSS为2.4g/L)和40mL液体培养基,其中碳源分别为H2/CO2(150mL,体积比4:1)或乙酸(500mg/L).将培养液pH值用1mol/LHCl或1mol/LNaOH调至7.0.然后将血清瓶分别置于5个恒温空气浴摇床(15,20,25,30,35℃)进行静态摇甁试验.每个温度梯度做3个平行样,数据分析取其平均值.每12h测定一次产气量,气体组成,每24h测定一次挥发酸组成.1.3DNA提取和qPCR分析取0.15g污泥样品用磷酸缓冲液冲洗若干次进行DNA提取.基因组DNA提取采用DNA提取试剂盒(MOBioLaboratories,Inc.,Carlsbad,CA,USA).以前的研究发现,该UASB反应器中的产甲烷菌主要来自产甲烷丝状菌属(Methanosaeta)和产甲烷螺旋菌属(Methanospirillum)[11].因此,对这两个属的产甲烷菌进行定量分析.所用引物分别为,Methanosaeta,5′-GCATCGAGATTTAAAGCTC-3′,5′-AGCCAGATTTGTAACCTGGC-3′;Methanospirillum,5′-AACGGCCCAACAAGCCTGTC-3′,5′-GGACTTGTATATCCAGCACG-3′.本实验中的定量分析采用绝对定量方式.标准样品为含目的基因序列的重组pMD18-T质粒.将标准样品进行10倍梯度稀释(101~107).标准样品和待测样品同时进行实时荧光定量PCR检测(qPCR).qPCR在荧光定量分析系统(Model7500,ABI,Foster,CA,USA)中完成,所用荧光染料为SYBRgreen.反应体系:引物1μmol/L,SYBRGreenMix10μL(ToyoboCo.,LTD.,Japan),H2O5.96μL,ROX0.04μL,DNA模板3μL.反应程序:94℃预变性1min,94℃15s,58℃30s,72℃35s数据采集,40个循环.每个qPCR反应设置3个重复.以达到对数增长时的循环数(Ct值)为横坐标,标准质粒数目的对数值为纵坐标绘制标准曲线,得到关于Methanospirillum和Methanosaeta的一元线性回归方程分别为y=-0.3051x+11.626(R2=0.9929),y=-0.2669x+10.455(R2=0.9982).1.4分析项目及方法生物量(挥发性悬浮固体总量MLVSS)采用标准方法测定[12],甲烷发酵产气量通过10~50mL的玻璃注射器排气计量.发酵气体的组分和挥发酸浓度分别采用山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司的SP-6800A型(TCD检测器)和SP-6890型(FID检测器)气相色谱测定.累计甲烷产量参照Owen法进行计算[13].1.5动力学分析不同温度下的产甲烷动力学分析参照Gompertz模型.公式如式(1):()maxmaxmaxeexpexp1RMPtPλ⋅⋅⎧⎫⎡⎤=−−+⎨⎬⎢⎥⎣⎦⎩⎭其中:M为反应t(h)累计甲烷产量,mL;Pmax为最大产甲烷量,mL;Rmax为最大产甲烷速率,mL/h;,λ为延迟时间,h.将累计甲烷产量和相应反应时间代入公式,用统计软件Origin8.0计算出Pmax、Rmax、λ[14].2结果与讨论2.1产甲烷菌的定量分析在进水COD3000mg/L和35℃条件下,UASB的COD去除率为95%,比产甲烷速率为0.26L/gCODremoved,说明一些较高活性的产甲烷菌存在于该系统中.基于16SrRNA基因序列的PCR-DGGE分析表明,产甲烷丝状菌属(Methanosaeta)为该系统中优势乙酸营养型产甲烷菌,而优势氢营养型产甲烷菌为产甲烷螺旋菌属(Methanospirillum)[11].产甲烷丝状菌只能利用乙酸作为底物,而产甲烷螺旋菌只能利用H2/CO2作为底物[15-16].为了考察UASB中这两类产甲烷菌的数量,对它们进行了qPCR分析.结果表明,Methanosaeta的数量为2.7×10516S1084中国环境科学36卷rRNA基因拷贝数/ngDNA.Methanospirillum的数量比Methanosaeta少了2个数量级,只有1.8×10316SrRNA基因拷贝数/ngDNA.已有研究结果表明,在乙酸含量较低的生物反应器中Methanosaeta为优势乙酸营养型产甲烷菌,而且Methanosaeta在颗粒污泥中的含量要高于絮状污泥[17-18].这可能是由于产甲烷丝状菌特殊的形态有利于颗粒污泥形成的原因.2.2甲烷生成对温度胁迫的响应规律定量分析的结果表明,氢营养型产甲烷菌和乙酸营养型产甲烷菌分别来自产甲烷螺旋菌属和产甲烷丝状菌属.H2/CO2和乙酸不仅是产甲烷菌可利用的主要底物,而且是有机物厌氧生物处理过程中重要的中间代谢产物.为了了解温度对不同营养类型产甲烷菌活性的影响,本研究分别以H2/CO2和乙酸作为底物考察温度降低对氢营养型产甲烷菌和乙酸营养型产甲烷菌活性的影响.图1表明,在35℃条件下,接种培养60h后累计产甲烷量就达到了最大值24.7mL.当温度从35℃分别降低至30℃和25℃时,甲烷生成速率降低,最终累计产甲烷量比对照(35℃)减少了14.2%和34.0%(表1).当温度分别降低至20℃和15℃时(图1),甲烷的生成出现了明显的停滞期,该停滞期约为24~28h,表明低温对氢营养型产甲烷菌代谢活性造成了显著抑制作用.经过24~28h的停滞期后,累积产甲烷量开始逐渐增加,表明氢营养型产甲烷菌经过24h的适应,其代谢活性缓慢恢复.累计产甲烷量最后分别稳定在13.1,10.5mL左右.值得注意的是,20和15℃时的累积产甲烷趋势与35,30,