XH02菌强化反应器脱氮过程中菌群结构的高通量分析

中国环境科学2017,37(5)：1922~1929ChinaEnvironmentalScienceXH02菌强化反应器脱氮过程中菌群结构的高通量分析黄郑郑1,曹刚1,2*,李紫惠1,陈海升1,莫测辉1,2(1.暨南大学环境学院,广东广州510630；2.广东省污染控制与修复材料工程技术中心,广东广州510630)摘要：为了强化生物反应器脱氮以及揭示微生物菌群结构随时间的动态变化,以OchrobactrumanthropiXH02和SBR反应器为研究对象,利用16SrDNA高通量测序技术,对不同时期反应器中微生物的菌群结构和多样性进行了动态分析.研究结果表明,XH02菌的加入使得反应器中TN和COD的去除率分别提升了15%和10%以上;反应器中微生物菌群在属水平上的相对丰度和多样性呈先下降后上升的趋势;XH02的加入对菌群结构产生了较大影响.Acinetobacter、Blvii28和Aquabactenium菌的相对丰度显著下降,而Fontibacter和Treponema菌的相对丰度则在强化过程中显著升高;XH02的相对丰度随着反应器的运行逐渐增加,最后形成了较为稳定的菌群;主成分分析和UPGMA聚类分析大致把反应器运行过程分成4个阶段.关键词：异养硝化-好氧反硝化；生物多样性；高通量测序技术；SBR反应器；菌群结构中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1000-6923(2017)05-1922-08High-throughputsequencinganalysisofcommunitystructureinreactorenhancedbyheterotrophicnitrification-aerobicdenitrificationbacteriaXH02.HUANGZheng-zheng1,CAOGang1,2*,LIZi-hui1,CHENHai-sheng1,MOCe-hui1,2(1.SchoolofEnvironment,JinanUniversity,Guangzhou510630,China；2.GuangdongEngineeringCenterforEnvironmentContaminationControlandRestorativeMaterials,Guangzhou510630,China).ChinaEnvironmentalscience,2017,37(5)：1922~1929Abstract：Toimprovethedenitrificationofbio-reactorandrevealdynamicchangesofmicrobialcommunitystructureovertime,themicrobialcommunitystructureanddiversitywereanalyzedbyhigh-throughputsequencingtechnologyindifferentstagesoftheSBRreactorinoculatedwithheterotrophicnitrification-aerobicdenitrificationXH02.ResultsshowedthattheremovalratesofTNandCODincreasedbymorethan15%and10%,respectively.Therelativeabundanceanddiversityofmicrobialfloraonthegenusleveldecreasedatfirstandthenincreased.XH02exertedagreatinfluenceonthemicrobialcommunitystructureofindigenousmicroorganisms,leadingtoasignificantdecreaseintherelativeabundanceofAcinetobacter,Blvii28andAquabactenium,butavisibleincreaseintherelativeabundanceofTreponemaandFontibacter.TherelativeabundanceofXH02increasedgraduallywiththeoperationofthereactoruntilarelativelystableflorawasfinallyestablished.TheSBRoperationwasroughlydividedintofourstagesbasedontheresultsofprincipalcomponentanalysis(PCA)andUPGMAclusteranalysis.Keywords：heterotrophicnitrification-aerobicdenitrification；biologicaldiversity；highthroughputsequencingtechnology；SBR；microbialcommunitystructure微生物在水体氮循环中发挥着重要作用[1].污水中氮素的去除主要通过微生物菌群的硝化和反硝化作用来实现[2].传统的生物脱氮技术中硝化和反硝化不能同时进行,必须通过两个独立的过程来完成.而异养硝化-好氧反硝化脱氮技术实现了在同一个反应器中同时完成硝化和反硝化作用,有效缩短了反应途径,且脱氮效率更高、反应速率更快.目前,国内外利用异养硝化-好氧反硝化菌强化污水脱氮已取得了较好的效果[3-5],但大部分研究只关注强化过程的脱氮效率以及影响因素,而对反应器中微生物菌群结构的变化研究较少.分子生物学的快速发展,为研究微生物菌群收稿日期：2016-09-22基金项目：国家基金委-广东省政府联合基金重点项目(U1501233);广东省基金研究团队项目(2016A030312009);广东省环境污染控制与修复材料工程技术研究中心建设项目(2015B090903070)*责任作者,副教授,[e-mail]5期黄郑郑等：XH02菌强化反应器脱氮过程中菌群结构的高通量分析1923结构提供了多种方法,包括RFLP[6]、16SrRNA文库构建[7]和PCR-DGGE[8-9]等.但这些传统方法效率较低,得到的数据信息有限,不能有效、系统地反映群落的丰度和多样性.而高通量测序技术具有通量高、数据量大、准确率高、测序周期短以及成本低等优点[10],在微生物学研究中具有很强的优越性,广泛应用于各种分子生物学领域[11-15].本研究将实验前期筛出的异养硝化-好氧反硝化菌OchrobactrumanthropiXH02活化后投加到SBR反应器中,建立微生物强化系统.利用高通量测序技术分析加入XH02菌前后反应器中微生物菌群的相对丰度和多样性随着运行阶段的变化,并对各阶段的微生物菌群结构进行了主成分分析和聚类分析.以阐明微生物菌群结构随着反应器运行的动态演替过程.为后续通过改变环境条件来调控反应器中菌群结构,进而提高反应器处理效率提供依据.以期为污水生物脱氮提供一定的理论和技术参考.1材料与方法1.1材料1.1.1菌源从广州大坦沙污水处理厂好氧污泥中筛选出一株异养硝化-好氧反硝化菌XH02[16],经过16SrDNA鉴定,此菌为人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi),GenBank的登录号为KU999381.1.1.2污泥来源广州大坦沙污水处理厂A2/O工艺中的好氧活性污泥.1.1.3人工合成水质反应器进水采用人工配水水质,如表1所示.表1人工合成水质Table1WaterqualityofthesyntheticwastewaterNH4+-NNO3--NNO2--NCOD水质指标(mg/L)(mg/L)(mg/L)(mg/L)pH值范围80.0~100.050.0~60.050.0~60.0800.0~1000.07.2~7.51.2SBR反应器的建立与运行SBR反应器由有机玻璃加工而成,有效容积为1.5L,采用向上流进水,利用鼓风曝气,气水同向运行.将新鲜的活性污泥接种于SBR反应器中,周期设定为12h,进水2h,反应9h25min,沉淀30min,出水5min,期间控制进水流量为1L/d,空气从底部经曝气头扩散进入反应体系中,用空气流量计调节进气量为4.0L/min,温度控制在30℃左右.加入XH02菌之前,每隔2d测定出水的各个指标,待反应器稳定后加入XH02,每隔3d测定出水水质指标.1.3取样方法和检测项目SBR反应器在加入XH02之前的稳定期,取一份污泥样品保存.XH02加入反应器后,在第2h取样一次,然后每隔3d取一次污泥样品,直至21d,共取污泥样品9份,用于DNA的提取,取污泥样品的同时,采集出水,并测定COD、TN、NH4+-N、NO3--N和NO2--N的浓度变化.1.4细菌总DNA的提取每次取污泥样品20mL,加入50mL锥形瓶中,120r/min摇床震荡10min使污泥破碎均匀.取10mL于15mL的离心管中,8000r/min离心10min,弃去上清液,收集沉淀,上述步骤重复一次.取5mL新鲜污泥进行总DNA的提取[17],设3个平行,提取的DNA一部分于-20℃保存,另一部分在0.7%的琼脂糖凝胶中做电泳检测,并将电泳条带进行扫描拍照.1.5IlluminaMiseq高通量测序首先进行PCR扩增,引物为细菌16SrDNA引物515F5'GTGCCAGCMGCCGCGG3';907R5'CCGTCAATTCMTTTRAGTTT3',PCR扩增产物用IlluminaMiseq平台双端测序分析.PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物,2%琼脂糖凝胶电泳检测.1.6微生物群落结构和多样性分析多样性分析前必须对原始序列去杂,然后进行拼接,通过标签找回每个样品对应的序列,低质量的序列被去除.质量控制标准包括:无错配碱基、精确匹配引物和barcode、无模糊碱基、长度大于300bp.采用CD-HIT分类法对有效数据在97%水平上进行OTU划分,并与Greengenes数据库比对,通过RDPclassifierNaiveBayesian分类算法对代表序列在门、纲、目、科和属5个水1924中国环境科学37卷平上进行分类注释.用Chao指数公式[18]分析样品的物种丰度,用Shannon和Simpson指数公式[19]分析样品的物种多样性.并用Canoco和Mothur软件分别进行主成分分析和聚类分析.2结果与讨论2.1XH02菌对COD和氮素的去除特性菌株XH02对COD、TN、NH4+-N、NO3--N和NO2--N的去除特性见图1.如图1(a)所示,以NH4+-N为底物的异养硝化过程中,第60h菌株XH02对COD、TN和NH4+-N的去除率分别为81.10%、62.74%和95.01%;由图1(b)可知,以NO3--N为底物的好氧反硝化过程中,第60h菌株XH02对COD、TN和NO3--N的去除率分别为达到75.73%、70.49%和100%;图1(c)给出了菌株XH02以NO2--N为底物时的反硝化过程,60h时XH02菌对COD、TN和NO2--N的去除率分别为86.15%、80.40%和97.35%.01224364860020406080100去除率(%)培养时间(h)CODTNNH4+-N(a)01224364860020406080100去除率(%)培养时间(h)CODTNNO3--N(b)01224364860020406080100去除率(%)培养时间(h)CODTNNO2--N(c)图1XH02菌对COD、NH4+-N、NO3--N和NO2--N的去除特性Fig.1RemovalcharacteristicsonCOD,NH4+-N,NO3--NandNO2--NofXH022.2SBR反应器的运行过程反应器的启动过程见