不同碳源促进污染水体氮素转化的微生态过程

浙江农业学报ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ，２０１６，２８（１１）：１９１５－１９２１ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｊｎｙｘｂ．ｃｎ赵佩文，王新，吴逸飞，等．不同碳源促进污染水体氮素转化的微生态过程［Ｊ］．浙江农业学报，２０１６，２８（１１）：１９１５－１９２１．ＤＯＩ：１０􀆰３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４⁃１５２４􀆰２０１６􀆰１１􀆰１７收稿日期：２０１６⁃０３⁃１４基金项目：浙江省公益技术应用研究项目（２０１５Ｃ３３０４６）；浙江省重大科技专项重点社发项目（２０１５Ｃ０３００４）；浙江省农科院创新提升工程项目；温州市水体污染控制与治理科技创新项目（Ｓ２０１４００２１）作者简介：赵佩文（１９９１—），女，湖北武汉人，硕士研究生，主要研究方向为微生物生态学。Ｅ⁃ｍａｉｌ：[e-mail]∗通信作者，汤江武，Ｅ⁃ｍａｉｌ：[e-mail]不同碳源促进污染水体氮素转化的微生态过程赵佩文１，２，王　新２，吴逸飞２，姚晓红２，柳　永２，孙　宏２，葛向阳１，汤江武２，∗（１．华中农业大学生命科学与技术学院，湖北武汉４３００７０；２．浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州３１００２１）摘　要：在试验条件下，向氮污染河道水体中Ｃ／Ｎ按１５∶１补加甲醇、乙醇、乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、羧甲基纤维素钠，检测水体氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、总氮的变化，以及在此过程中水体细菌胞外酶活性、细菌群落结构的变化。结果显示，除甲醇、羧甲基纤维素钠外，补加有机碳源显著降低了水体氨氮的含量，水体β⁃葡萄糖苷酶活性在碳源补加后快速增加，补加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的水体中细菌群落结构明显异于其他处理，表明添加有机碳源可显著加快污染水体中氮素的转化，水体微生物在此过程中起到关键作用。水体细菌群落结构和代谢活性对不同类型有机碳源有着不同的响应，因而添加不同有机碳源对水体氮素转化具有不同的促进作用。关键词：有机碳源；污染水体；细菌群落；ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ；细菌代谢活性中图分类号：Ｑ９３８􀆰１文献标志码：Ａ文章编号：１００４⁃１５２４（２０１６）１１⁃１９１５⁃０７Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｉｃｃａｒ⁃ｂｏｎｉｎｐｏｌｌｕｔｅｄｗａｔｅｒＺＨＡＯＰｅｉ⁃ｗｅｎ１，２，ＷＡＮＧＸｉｎ２，ＷＵＹｉ⁃ｆｅｉ２，ＹＡＯＸｉａｏ⁃ｈｏｎｇ２，ＬＩＵＹｏｎｇ２，ＳＵＮＨｏｎｇ２，ＧＥＸｉａｎｇ⁃ｙａｎｇ１，ＴＡＮＧＪｉａｎｇ⁃ｗｕ２，∗（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙ，ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｅｔｈａｎｏｌ，ｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ，ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ｓｕｃｒｏｓｅ，ｍａｌｔｏｓｅ，ａｎｄＣＭＣ⁃Ｎａｗａｓａｄｄｅｄｉｎｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｐｏｌｌｕｔｅｄｕｒｂａｎｒｉｖｅｒｗａｔｅｒｗｉｔｈＣ／Ｎｏｆ１５∶１．Ｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆａｍｍｏｎｉａ，ｎｉｔｒｉｔｅ，ｎｉｔｒａｔｅ，ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｎａｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｍｅｔｈｏｄ，β⁃ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｆｌｕｏｒｏｇｅｎ⁃ｉｃｍｏｄｅｌｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ．ＩｔｗａｓｓｈｏｗｎｔｈａｔｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆａｍｍｏｎｉａｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｔｅｒｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓａｄｄｉｔｉｏｎｅｘｃｅｐｔｍｅｔｈａｎｏｌｏｒＣＭＣ⁃Ｎａ．Ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄβ⁃ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉｆｆｅｒｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙｗｉｔｈａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅ，ｓｕｃｒｏｓｅａｎｄｍａｌｔｏｓｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｃｏｕｌｄａｃｃｅｌｅｒａｔｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｉｎｔｈｅｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｐｏｌｌｕｔｅｄｗａｔｅｒ，ｉｎｗｈｉｃｈｍｉｃｒｏｂｅｓｐｌａｙｅｄｋｅｙｒｏｌｅ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｈａｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｖａｒｉｅｄｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎｓ，ｗｈｉｃｈｗｏｕｌｄｌｅａｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒｅｎｇｔｈｏｎｎｉｔｒｏｇｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎ；ｐｏｌｌｕｔｅｄｗａｔｅｒ；ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ；ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ；ｂａｃｔｅｒｉａｌｍｅｔａｂｏｌｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ　　随着我国工业化进程的加快和现代农业的发展，水环境污染加剧，对污染水体的修复和治理也成为相关研究的重要领域。生物修复技术具有环境友好、生态节能的优点，是最具发展前景的水体原位修复技术，水体污染物的转化、降解主要依赖微生物的作用，然而对于氮素污染水体而言，有机碳源的缺乏是水体氮素转化、去除的主要限制性因素［１－４］。不同有机碳源用于污染水体的氮素去除在成本、环境效应上具有显著的差异，不少研究人员开展了筛选适合不同水体环境修复有机碳源的研究，取得了较好的效果［５－９］。微生物对不同有机碳源有着不同的生态效应，补加碳源后微生物类群、群落结构、代谢活性等的变化必将对微生物强化修复产生重要的影响，然而迄今为止对于这个微生态过程尚缺乏了解。为此，以氮污染河道水体为研究对象，初步探索不同种类有机碳源补加对水体氮素转化、去除的微生态过程的影响，旨在为污染水体微生物强化修复技术的优化、应用提供有益参考。１　材料与方法１．１　供试水样及试验方法试验用水样采集自杭州市城郊河道，采样时水体温度２６􀆰３℃，ｐＨ值７􀆰３８，溶解氧含量２􀆰３７ｍｇ·Ｌ－１，水体氨氮含量８􀆰２０ｍｇ·Ｌ－１，总氮含量８􀆰４９ｍｇ·Ｌ－１，ＣＯＤＭｎ２３􀆰０ｍｇ·Ｌ－１，总磷０􀆰３３ｍｇ·Ｌ－１，ＴＯＣ７􀆰２４ｍｇ·Ｌ－１。水样分装在编号１—９的试验水槽中，每个水槽装入水量约２００Ｌ。以试验水样中氨氮含量为基准，以１５∶１的Ｃ／Ｎ将甲醇、乙醇、乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ⁃Ｎａ）等分别加入１—８号水槽中，各种试剂的总添加量依次为：甲醇５５􀆰３ｍＬ，乙醇４０􀆰０ｍＬ，乙酸钠５６􀆰２ｇ，柠檬酸钠６７􀆰０ｇ，葡萄糖４５􀆰１ｇ，蔗糖３９􀆰０ｇ，麦芽糖４１􀆰０ｇ，ＣＭＣ⁃Ｎａ４１􀆰４ｇ，以９号作为空白对照，试验环境温度设置为２４℃。河道中采集水样的水质和微生物指标为各试验槽的起始值，水样的采集时间分别为１２、２４、４８ｈ。１．２　β⁃葡萄糖苷酶活性的测定水体中β⁃葡萄糖苷酶活性的测定采用荧光模拟底物法（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃｍｏｄｅｌｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ＦＭＳ），参照文献［１０－１１］改进后的测定方法进行。每个样品均测定３个平行样，以平均值表示该水样中β⁃葡萄糖苷酶的活性。１．３　细菌群落结构分析１．３􀆰１　水样细菌总ＤＮＡ的提取采集５０ｍＬ水样，用０􀆰２２μｍ微孔滤膜过滤收集菌体，滤膜用铝箔包裹，液氮速冻后存于－２０℃冰箱备测。提取ＤＮＡ时，将收集了大量菌体的滤膜剪成碎片，然后采用ＭＯＢＩＯＰｏｗｅｒ⁃Ｗａｔｅｒ®ＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ，参照试剂盒附带的操作步骤，提取样品中的ＤＮＡ，获得的ＤＮＡ用Ｎａｎｏ⁃ｄｒｏｐ２０００检测后，存于－２０℃冰箱备用。１．３􀆰２　基因片段的ＰＣＲ扩增和ＤＧＧＥ分析用于ＤＧＧＥ分析的片段为细菌１６ＳｒＤＮＡＶ３区片段，所用引物为连有ＧＣ夹子的细菌３４１Ｆ和５１７Ｒ［１２］，参考文献［１０－１１］采用的方法，进行１６ＳｒＤＮＡＶ３区片段的扩增和ＤＧＧＥ分析。所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为８％，变性梯度４０％～６０％。电泳完成后，ＰＡＧＥ胶用ＥＢ染色并用天能凝胶成像系统获取ＤＧＧＥ图谱，经ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ⁃１⁃Ｄ软件进行数字化分析后，用Ｍａｔｌａｂ软件进行矩阵和主成分分析。１．３􀆰３　主要细菌种类的测序分析对ＤＧＧＥ凝胶中的主要条带进行切胶、ＰＣＲ回收、克隆转化，获得载有１６ＳｒＤＮＡＶ３区基因片段的阳性克隆，每个条带获得的阳性克隆随机挑选３个进行测序分析。获得的序列结果在ＧｅｎＢａｎｋ中进行ＢＬＡＳＴ分析，选取相似序列，用ＭＥＧＡ４􀆰１软件进行比对后，以Ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建主要细菌种类的系统发育树。１．４　分析方法水样中氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、总氮含量的测定，均采用对应国家标准进行，分别为ＨＪ５３６—２００９、ＨＪ／Ｔ１９７—２００５、ＨＪ／Ｔ３４６—２００７、ＨＪ６３６—２０１２。水样中ＴＯＣ的测定采用耶拿Ｎ／Ｃ３１００型总有机碳测定仪，参照仪器提供的方法进行测定，均测定３个平行。·６１９１·浙江农业学报　第２８卷　第１１期１．５　数据统计分析采用ＳＰＳＳ１３􀆰０软件进行单因素方差分析（ｏｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ），对有显著差异的各处理采用Ｔｕｋｅｙ法进行多重比较。２　结果与分析２．１　水体总有机碳和氮素含量的变化有机碳源的加入，使得试验水体的总有机碳含量与对照组相比增加了１５倍左右。在水体土著微生物的作用下，随时间延长，总有机碳含量逐渐降低，其中，添加ＣＭＣ⁃Ｎａ的试验水体中，微生物对总有机碳利用能力较差（图１）。添加有机碳源后，各处理的水体氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、总氮均发生了变化。不同有机碳源对氨氮的变化有着不同的影响，相较于对照组，除了添加甲醇、ＣＭＣ⁃Ｎａ的试验水体外，氨氮含量在有机碳源添加之后均呈显著下降趋势，但降至一定值之后呈平稳趋势。添加葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的试验水体中，氨氮含量在１２ｈ后迅速从８􀆰２ｍｇ·Ｌ－１降低至３􀆰２ｍｇ·Ｌ－１以下，去除率超过６０％，显著优于添加其他碳源的试验水体（图１）。图１　添加有机碳源后试验水体中总有机碳、氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、总氮含量的变化Ｆｉｇ．１　Ｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎ，ａｍｍｏｎｉａ，ｎｉｔｒｉｔｅ，ｎｉｔｒａｔｅ，ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｗａｔｅｒｓａｆｔｅｒａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｄｉｆ⁃ｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｉｃｃａｒｂｏｎ·７１９１·赵佩文，等．不同碳源促进污染水体氮素转化的微生态过程和氨氮含量的变化趋势相反，各试验水体中亚硝酸盐的含量在添加有机碳源１２ｈ后迅速升到高点，然后呈下降趋势（图１）。添加不同种类碳源对水体硝酸盐含量变化的影响不同，添加乙酸钠、葡萄糖、麦芽糖处理的水体中硝酸盐的含量在１２ｈ内显著升高，在１２—２４ｈ呈下降趋势，但在２４ｈ后与添加其他各类碳源的处理一样呈升高趋势（图１）。相较于对照组，添加有机碳源的各试验水体中总氮含量均呈显著的下降趋势，其中，加入乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖的水体中４８ｈ后总氮去除率为１９􀆰０％～２１􀆰３％，显著高于其他处理（图１）。２．２　水体β⁃葡萄糖苷酶活性的变化β⁃葡萄糖苷酶是水体细菌转化、利用碳源的关键胞外酶，是细菌生态活性和功能的重要指标。试验水体中添加柠檬酸钠、葡萄糖、蔗糖之后，β⁃葡萄