传统生物脱氮反硝化过程的生化机理及动力学

应用与环境生物学报2008，14(5):732~736ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X2008-10-25DOI:10.3724/SP.J.1145.2008.00732传统生物脱氮反硝化过程的生化机理及动力学*王淑莹**孙洪伟杨庆彭永臻(北京工业大学北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室北京100022)BiochemicalReactionMechanismandKineticsofDenitrification*WANGShuying**,SUNHongwei,YANGQing&PENGYongzhen(KeyLaboratoryofBeijingforWaterQualityScienceandWaterEnvironmentRecoveryEngineering,BeijingUniversityofTechnology,Beijing100022,China)AbstractConventionalbiologicaldenitrificationincludesaserialsofbiologicalreductionprocesseswithnitrateaselectronacceptor,bythecatalysisofcorrespondingnitratereductase(NaR),nitritereductase(NiR),nitricoxidereductase(NoR)andnitrousoxidereductase(N2oR).Thebiochemicalreactionmechanismandkineticsofdenitrificationarethetheoreticalfoundationofbiologicalnitrogenremoval.Inordertopromotefurtherdevelopmentofbiologicalnitrogenremoval,itisnecessaryandsignificanttounderstandthecomplexbiochemicalreactionmechanismsofbiologicaldenitrificationanditselectronflowandenergyproductionpathway.Thispaper,throughthediscussionofthecomplexmechanisms,putsforwardthecomplexbiochemicalreactionprocessofbiologicaldenitrification,includingmanyenzymesandvariousintermediateproducts,andinvolvingelectronflow(energyproduction),analyzestheelectrontransfermodelinwhichelectrontransfersfromNADHtoterminalelectronacceptor,andthetypeofenergyproductionbasedonthechemiosmotichypothesisestablishedbyPeter,andalsoproposestoadaptintegralanddifferentialmethodstosolvethekineticsconstantvaluesνmax,NO3，μDmax，KS,NO3-Fig1,Ref27Keywordsdenitrification;biochemicalmechanism;kinetics;electronflowCLCX703.1摘要传统生物脱氮是指以硝酸盐为电子受体的一系列生物还原反应过程，该过程是在硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶的作用下完成的.反硝化的生化机理及动力学是生物脱氮技术的理论基础.为促进反硝化生物脱氮技术的进一步发展,理解反硝化一系列复杂的生化反应过程及其电子传递、能量转化模式是十分必要而有意义的.本文通过对反硝化生化反应过程相关机理的论述,系统归纳了一个涉及多种酶及多种中间产物并伴随着电子(能量)传递的复杂反硝化生化反应过程，详细总结分析了反硝化过程电子通过电子传递链从电子供体（NADH）传递到终端电子受体的传递模式，以及借助于Peter提出的化学渗透假说建立的能量产生方式.同时建议采用积分法和微分法来确定反硝化动力参数νmax,NO3，μDmax，KS,NO3-.图1参27关键词反硝化;生化机理;动力学;电子传递CLCX703.1收稿日期:2007-08-13接受日期:2008-04-19*国家“十一五”科技支撑计划重点项目(No.2006BAC19B03)SupportedbytheKeyTechnologyR&DProgramforthe11thFive-yearPlanofChina(No.2006BAC19B03)**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:[e-mail])反硝化过程是伴随电子传递而发生硝酸盐呼吸的生化反应过程[1].从物质转化角度看，硝酸盐通过异化硝酸盐还原作用将硝酸盐还原为一氧化氮、一氧化二氮和氮气.从电子传递模式角度分析，反硝化菌利用硝酸盐和亚硝酸盐中的+V价和+III价N作为电子受体，-II价O作为受氢体生成H2O和OH－碱度，从能量转化模式角度看，有机物作为微生物生长的碳源、电子供体，并提供能量.Sharma等[2](1977)提出了反硝化的生化反应过程.YeRW等[3](1994)，Loosdrecht等[4](1998)从微生物角度对该生化反应过程进行了完善.Feleke等[5]、Killingstad等[6]和Rijn等[7]众多学者对其进行了应用.Madigan等[8](1997)对反硝化过程的电子传递模式进行了研究.我国学者郑平[9]也报道了反硝化过程的电子传递模式.但目前系统论述反硝化过程的物质转化途径、电子传递模式、能量产生方式及相应酶特性的文献资料较少.对于反硝化动力学常数，目前普遍采用的是Henze和Grady(1987)推荐IAWPRCASM模式I中的免误数值[10].由于文献报道反硝化动力学参数范围较大，结论也不尽相同.因此，在具体的试验过程中，如何确定试验条件下的反硝化动力学参数显得尤为重要.本文基于反硝化的物质转化途径、电子传递模式及能量产生方式三方面，详述反硝化的生化反应机理，同时给出确定反硝化动力学参数的方法，从而为生物脱氮生化反应系统合理化、科学化的设计和运行奠定基础.1反硝化的生化机理反硝化作用也称硝酸盐呼吸.反硝化菌是硝酸盐呼吸的载体，离开了反硝化菌，硝酸盐呼吸也将不复存在[9].反硝化菌在种类学上没有专门的类群.很多细菌都被证明具有反硝化能力.闫志英等[11]对反硝化菌的类型及特性进行了详细的报道.ChunChinWang等[12]在ABS废水处理厂中分7335期王淑莹等：传统生物脱氮反硝化过程的生化机理及动力学离出降解己内酰胺的反硝化菌.OskarModina等[13]发现了以甲烷为碳源的反硝化菌.在细菌界,反硝化菌属主要是Proteobacter门细菌和非Proteobacter门细菌，Proteobacter门下的α-Proteobacteria纲、β-Proteobacteria纲、γ-Proteobacteria纲和ε-Proteobacteri纲内都含有大量的反硝化菌.近年来，国外学者在反硝化的生化机理等方面进行了深入研究，尤其是在反硝化菌的电子传递及能量产生模式等方面.1.1反硝化的物质转化途径反硝化过程是一个涉及多种酶和多种中间产物并伴随着电子传递和能量产生的复杂生化反应过程.大量研究表明，反硝化是涉及4种酶(硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶、一氧化二氮还原酶)的四步生化还原反应.首先，硝酸盐在硝酸盐还原酶(Nitratereductase,NaR)的作用下，被还原成亚硝酸盐.2289.2kjeHNOHNOOmol3221NaR+++--+--(1)该反应中，需要两个外源电子将硝酸盐中N5+还原为亚硝酸盐中N3+,+，同时脱下的一个O2-与细胞质中水分解产生的2H+结合生成H2O.反应放出82.9kJmol-1的能量.NaR在革兰氏阴性菌中似乎是周质酶，是膜结合蛋白，他们的合成受O2的限制，只有在无氧的条件下才能合成.Kirstein等[14]的研究表明，反硝化菌细胞内存在两种硝酸盐还原酶，即位于细胞膜内侧的膜内硝酸盐还原酶和位于细胞膜外侧的膜外硝酸盐还原酶.两种硝酸盐还原酶在生理功能、催化活性中心等方面具存在较大差异性，但他们的亚单位中均含有钼(Mo)原子，Cytb或Cytc.第二步，亚硝酸盐在亚硝酸盐还原酶(Nitritereductase,NiR)的作用下被还原成NO，NO是反硝化过程中的第一个气态中间产物，有剧毒.32.9kj2eNOHNOHOmol221NiR-+++-+-(2)该反应需要一个电子将亚硝酸盐中N3+还原成N2+，同样需要2H+与O2-结合生成H2O.NiR存在于细胞膜外细胞周质中，似乎是周质酶[15].有含c和d1两种细胞色素的Cytcd1型和含Cu催化中心的Cu型两种类型，相对分子质量(Mr)为120×103和36×103.NiR的Mr为63×103，适宜pH值为6.1[16].第三步，在一氧化氮还原酶(NOoxidoreductase,NoR)的作用下，NO被还原成N2O.22226.4kjeH2NOHNOOmol221NoR+++-+-(3)该反应需要2e和2H+将NO还原成N2O和H2O，Walter[17]等的研究表明，NoR位于细胞膜上，是一种与膜结合的细胞色素bc复合物.由两个Mr分别为53×103和16.5×103亚单位组成.这两个亚单位分别与Cytb和Cytc结合，同时该酶含有非血红素铁.第四步，在一氧化二氮还原酶(N2Oreductase,N2oR)的作用下，N2O被还原成N2.2261.8kjeH2NOHNOmol2221NoR2+++-+-(4)该反应所需的2e用于N2O(+I价N)到N2(0价N)的还原，生成了自然界中氮的最稳定形式—氮气.PatrickWu等[18]的研究表明，N2oR为细胞周质酶，是Mr为67×103的含有两个Cu活性中心同型二聚体.反应放出261.8kJmol-1的能量，是反硝化生化反应中放能最多的.从以上生化反应看出，在反硝化过程中，共放出约604kJmol-1的能量，这些能量即使全部转化为ATP，约可产生11.5molATP，属于低级能源.同时每步生化反应均涉及电子和质子的传递及能量的转化，因此，了解反硝化过程的电子传递和能量转化是十分必要的.1.2反硝化过程的电子传递模式在反硝化物质转换途径的基础上，结合其生化反应过程及电子传递模式图1，详述反硝化的电子传递过程.从生化反应式可以看出，1mol硝酸盐还原为氮气需要7个电子和8个质子.对于异养型的反硝化菌，电子通过电子传递链[8](由与细胞膜紧密结合的电子载体NADH，FP，FeS，CoQ，Cytb，Cytbc1复合物，Cytc等辅酶组成的电子传递系统)传递给终端电子受体硝酸盐.要理解反硝化菌的电子传递，首先清楚以下3方面内容：(1)反硝化菌细胞膜内电子载体的还原电动势大小顺序如下[19]：NAD+/NADH(－0.32V)FP(-0.30V)FeS(－0.18V)Cytbox/red(+0.030V)Cytbc1(+0.032V)CoQ/CoQH2(+0.100V)Cytcox/red(+0.254V)NO3-/NO2-(+0.433V).(2)细胞色素和FeS在电子传递链中仅传递电子，当电子通过两者时，质子被泵出至膜外.CoQ(辅酶Q)即携带电子又携带质子[20].(3)NaR是从CoQ中获得电子的，而NiR、NoR和N2oR均