低温低碳氮比好氧反硝化菌的筛选及鉴定

收稿日期：2013-11-15；修回日期：2014-02-25基金项目：吉林省重大科技攻关项目（20130204054SF）；国家环境保护公益性行业科研专项（201009009）作者简介：周兰影，博士研究生，研究方向为水处理技术，电子信箱：[e-mail]；张凤君（通信作者），教授，研究方向为水处理技术，电子信箱：[e-mail]引用格式：周兰影,马秀兰,张晨东,等.低温低碳氮比好氧反硝化菌的筛选及鉴定[J].科技导报,2014,32(11):33-37.低温低碳氮比好氧反硝化菌的筛选低温低碳氮比好氧反硝化菌的筛选及鉴定及鉴定周兰影1,2，马秀兰3，张晨东3，王呈玉3，张凤君11.吉林大学地下水资源与环境教育部重点实验室，长春1300212.吉林省产品质量监督检验院，长春1300223.吉林农业大学资源与环境学院，长春130118摘要摘要传统的反硝化工艺存在反硝化细菌的世代时间较长（特别是在低温的冬季）、水力停留时间长、运行和投资费用大等问题。为寻找更好的反硝化细菌，从冬季北方城市污水厂驯化活性污泥中分离出1株耐低温、低碳氮比，且脱氮率较高的好氧反硝化菌株，命名为HFX08。初步鉴定该菌株为假单胞菌属（Pseudomonas），G-菌。该菌株的最适生长温度为10~20℃，生长曲线符合S型曲线，拟合方程相关性系数达到了差异极显著水平。随着碳氮比的增加，该菌株的反硝化速率随之提高，脱氮率最高可达92%。关键词关键词好氧反硝化菌；假单胞菌属；脱氮率；碳氮比；低温中图分类号中图分类号X172文献标志码文献标志码Adoidoi10.3981/j.issn.1000-7857.2014.11.004ScreeningandIdentificationofanAerobicDenitrifyingBacteriumwithLowC/NRatioatLowTemperatureAbstractAbstractTheconventionaldenitrificationprocesshaslimitedapplicationsduetoitsdisadvantages,suchaslonggenerationtimeofdenitrifyingbacteria,especiallyincoldwinter,longhydraulicretentiontimeandhighcosts.Inthisstudy,anaerobicdenitrifyingbacteriumdesignatedasHFX08wasisolatedfromadomesticsewageplantinanortherncityofChinainwinter.ThestrainHFX08exhibitedhighdenitrificationperformanceunderlowC/Nratioatlowtemperature.TheresultsindicatedthatthestrainHFX08wasG-andidentifiedasPseudomonassp.Theoptimumtemperatureforitsgrowthisintherangeof10-20℃.ItsgrowthcurvewasfittedtoSgrowthcurve,whosefittingcoefficientreachedthelevelofextremelysignificantdifference.ThenitrogenremovalratebystrainHFX08increasedwithincreasingC/Nratio,upto92%.KeywordsKeywordsaerobicdenitrifyingbacterium;Pseudomonas;nitrogenremovalrate;C/Nratio;lowtemperatureZHOULanying1,2,MAXiulan3,ZHANGChendong3,WANGChengyu3,ZHANGFengjun11.KeyLaborotaryofGroundwaterResourcesandEnvironmentofMinistryofEducation,JilinUniversity,Changchun130021,China2.InstituteofSuperuisionInspectiononProductQualityofJilinProvince,Changchun130022,China3.CollegeofResourcesandEnvironment,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China随着人民生活水平的提高，饮食结构的不断改变，城市生活污水的水质成分有了很大的变化，含氮量增加，出现了低碳氮比（C/N比，质量比）的情况[1,2]。传统的污水处理技术已经不能满足排放要求，因此脱氮技术的研究和应用引起人科技导报2014，32（11）们的广泛关注。传统的反硝化作用是微生物在厌氧环境中，利用NO-3-N作为电子受体，同时将其还原为N2的过程[3,4]。好氧反硝化指在有氧情况下将NO-3-N转化为N2的过程。近年来，国内外不少研究和报道证明了好氧反硝化菌的存在[5,6]。Krul等[7]最早给出好氧反硝化反应的科学论证；Robertson等[8]在实验室观察到有氧条件下发生了反硝化现象。国内外已经发现的好氧反硝化菌有Thiosphaerapantotropha、Pseudmonassp.和Alcaligenesfaecalis、Pseudomonasnautical、Thaureamechernichensis、Alcaligenessp、Microvirgulaaerodenitrificans等[9~12]。但国内关于低温、低碳氮比好氧反硝化细菌分离的报道甚少。本研究从已驯化的低温、低碳氮比城市活性污泥中分离出1株好氧反硝化细菌，验证其反硝化性能，确定温度、C/N比对菌株反硝化特性的影响，以期为北方地区冬季低C/N比污水处理工艺设计和操作提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1培养基反硝化液体培养基：KNO32g，KH2PO40.5g，MgSO40.25g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.0~7.2，再加入乙酸钠（控制C/N=4），121℃灭菌20min。反硝化富集固体培养基：每升反硝化液体培养基中加入15g琼脂粉。溴百里酚（BTB）培养基：BTB1g，KNO31g，FeCI2·6H2O0.05g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O1g，CaCl20.2g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.0~7.2，加入15g琼脂粉，培养基呈墨绿色，121℃灭菌20min。LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏1g，NaCl8g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.0~7.5。1.1.2仪器及试剂PCR扩增仪（PCRSystem9600，Perkin-Elmer公司），电泳仪（Dcy-33A，北京六一仪器厂），紫外凝胶成像系统（大连宝生物公司），高速离心机（Sigma4K15，Sigma公司，美国），电泳槽（DYY-6C，北京六一仪器厂）。KNO3、KH2PO4、MgSO4、BTB、FeCI2·6H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2均为分析纯，由北京化学试剂有限公司生产；蛋白胨、琼脂粉、酵母膏等由北京奥博星生物技术有限公司生产。1.2实验方法1.2.1菌种的富集、分离与鉴定取驯化污泥[13]10mL加入100mL反硝化富集培养液中，10℃、120r/min振荡培养，每7d转接1次，共转接5次；取100μL菌液在反硝化培养基上平板涂布；涂布后10℃培养，根据生长情况，一般为3~10d；挑选生长快、菌落大的单一菌株在固体培养基中反复划线分离，并在BTB培养基上点接，同时进行硝酸盐还原、亚硝酸盐还原性和反硝化性能检测。将初筛得到的菌种接种于100mL反硝化培养基中，10℃、120r/min下摇瓶培养，测定在对数生长期和稳定生长期的菌液的NO-3-N、NO-2-N和总氮的浓度，得到一株反硝化能力强的菌株，命名HFX08，挑取单一菌落接种于培养基中同驯化条件扩繁，达到对数生长期后，取1mL菌液放入2mL离心管中，丙三醇封口，于-20℃冷冻保存，每隔3个月复壮1次。将分离纯化的HFX08菌株在反硝化培养基上扩繁，10℃培养，观察菌落特征和菌体形态结构并进行染色反应；对HFX08菌株进行葡萄糖产酸、接触酶、氧化酶、乙醇氧化、水解淀粉、水解明胶、吲哚等测定，以了解其生理生化特征[14]。HFX08菌株的硝酸还原性、反硝化性鉴定方法见《常见细菌系统鉴定手册》[14]。采用通用引物对HFX08菌株的16SrDNA进行PCR扩增（上海生工生物工程技术有限公司合成），正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR反应体系为：超纯水33.5μL、10×ExTaq缓冲液5.0μL、dNTP（10mmol/L）2.0μL、上游引物2.0μL、下游引物2.0μL、模板DNA5.0μL、ExTaq酶0.5μL，共计50μL。PCR的反应程序为：98.0℃预变性5min；80℃暂停；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。采用通用引物对纯化的HFX08菌株进行16SrDNA扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电脉检测，溴化乙锭染色，紫外凝胶成像观察。以DNAMarker为参照，对比Marker的亮带，菌株在1500bp处出现亮带，回收特异条带，由大连宝生物公司测序。1.2.2菌株生长曲线及反硝化能力测定保存的菌株接种于反硝化液体培养基中同培养条件活化后，10℃、120r/min振荡培养48h，10000r/min离心5min收集菌体，并用无菌水洗涤，离心、收集反复3次。然后将菌体按2%的接种量转入50mg/L以硝酸钾为氮源的新鲜反硝化培养基中继续活化，当达到对数生长期后，将活化的菌种按5%接种量接入反硝化液体培养基中，调节乙酸钠和硝酸钾的浓度，控制C/N比为4，每隔2h测定1次OD值，并按时测定NO-3-N的质量浓度。1.2.3不同C/N比对菌株反硝化能力的影响为探求C/N比对分离菌株反硝化效果的影响，实验过程中以乙酸钠为碳源，通过调整乙酸钠质量改变反硝化液体培养基中的C/N比，控制C/N比为2、3、4、6、8，培养48h后分别测定培养液中NO-3-N的质量浓度。1.2.4不同温度对菌株反硝化能力的影响以乙酸钠为碳源、硝酸钾为氮源的反硝化培养液中接入对数生长期的供试菌株，接菌量为5%，分别在5、10、15、20、25℃下，恒温振荡培养，分别测定NO-3-N质量浓度及去除率。科技导报2014，32（11）菌株进行革兰氏染色，用光学显微镜对其染色前后的形态进行观察。HFX08菌落呈圆形，直径1.5mm左右，表面呈脐突状隆起，光滑，黄色，不透明，菌落边缘光滑菌体形态为球形，G-菌。HFX08菌株生理生化实验表明，菌株的氧化酶、双水解酶、精氨酸双水解酶、反硝化性为阳性，明胶液化、水解淀粉为阴性。初步判定：HFX08为明胶水解，接触酶、柠檬酸盐、木糖苷酶阳性，氧化酶、葡萄糖产酸、谷氨酸转移酶阴性，表明其与假单孢菌属（Pseudomonas）有相类似特征。菌株的测序结果如图1所示。16SrDNA序列分析法是直接测序检测微生物群落的常用方法之一，是近10年来发展起来的一种分子指纹技术，广泛应用于分子系统发育分类学的研究，通过未知菌与基因库中已知种属的16SrDNA序列进行核苷酸同源性比较后进行系统发育分析，可以鉴定到属的水平。将HFX08菌的16SrDNA序列用Dnaman进行多重比对，该