二氧化碳背压对啤酒生成高级醇和酯的影响杨东升

酿酒科技2019年第2期（总第296期）·LIQUOR-MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY2019No.2(Tol.296)DOI：10.13746/j.njkj.2018239基金项目：海南省科技厅科研基金(317006)。收稿日期：2018-08-01作者简介：杨东升(1966-)，男，本科，高级工程师，主要从事生物化工研究工作。优先数字出版时间：2018-10-24；地址：。杨东升，李静，苏敏，李佳伟（海南大学材料与化工学院生物工程系，海南海口570228）摘要：在啤酒工业中研究了CO2背压作为改善啤酒质量的方法。本研究通过对不同浓度麦汁施以不同CO2背压发酵，测定在主发酵过程中不同的理化参数，研究了CO2背压和麦汁浓度对啤酒生成高级醇和酯含量的影响。对高级醇和酯生成速率的研究揭示了CO2背压对其生成延迟变化的规律。结果表明，CO2背压可以增加啤酒醇/酯比，影响和平衡啤酒风味，特别是对较高浓度麦汁啤酒的影响较大。关键词：啤酒；二氧化碳；背压；高级醇；酯中图分类号：TS262.5；TS261.4文献标识码：A文章编号：1001-9286（2019）02-0024-06EffectsofCO2BackPressureontheYieldofHigherAlcoholsandEstersinBeerYANGDongsheng,LIJing,SUMinandLIJiawei(SchoolofMaterialsandChemicalEngineering,HainanUniversity,Haikou,Hainan570228,China)Abstract:CO2backpressureisappliedinbreweriestoimprovebeerquality.Inthisstudy,differentCO2backpressurefermentationwasperformedinwortofdifferentconcentrations,thephysiochemicalindexesweremeasuredinchieffermentingprocess,andtheef-fectsofCO2backpressure/wortconcentrationontheyieldofhigheralcoholsandestersinbeerwasexplored,thentherulesinCO2backpressuredelayingtheyieldofesterswererevealedthroughtheanalysisoftherelationsbetweenhigheralcoholsandestersyieldratio.Theresultssuggestedthat,CO2backpressurecouldincreasetheratioofhigheralcoholstoestersinbeerandfurtherinfluenceandbalancebeerflavorandtaste,especially,CO2backpressurehadstrongerinfluenceonwortofhigherconcentrations.Keywords:beer;CO2;backpressure;higheralcohols;esters众所周之，啤酒的风味和香气对决定其质量至关重要，同时这些参数受到二氧化碳压力的影响[1-2]。一般认为，影响风味化合物产生的最直接因素是溶解二氧化碳，其浓度取决于所施加的温度和背压。另一方面，随着市场需求的增加，啤酒厂不断增大啤酒生产的反应器尺寸。巨大的发酵罐自然产生更高的静水压力，通常会增加溶解在啤酒中的二氧化碳浓度。在许多生物体中，包括酵母菌，高二氧化碳分压对其生长有抑制作用[3-4]。啤酒中所有风味活性成分都是由酵母产生的，这些化合物最终将决定啤酒的最终质量[5]。高级醇、酯类、乙醛、二甲基硫醚（DMS）和二氧化硫等是啤酒风味的关键元素。啤酒酵母产生的高级醇是啤酒中最丰富的感官成分。高级醇的形成与酵母代谢氨基酸有关。这些化合物的产生可以通过两个途径发生。第一是埃利希提出的分解代谢途径[6]，第二是氨基酸合成途径[7]。正丙醇、异丁醇和异戊醇是啤酒中最重要的高级醇。异戊醇的气味阈值范围为25mg/L，正丙醇为50mg/L[8]。即使某些高级醇或酯的实际浓度低于它们的阈值，但其存在对于整体风味分布也很重要[9]。啤酒中的高级醇既是风味活性化合2424物，又是与酰基辅酶A衍生物反应生成酯的底物。有众多的因素影响高级醇的形成，其中有酵母菌种、发酵温度、酵母接种量、麦汁组成、麦汁通氧等[10]。高级醇的形成不仅会随着较低的接种温度和发酵温度而减少，也会随着CO2压力的作用而降低[7，11]。有研究表明，较高的温度增加了发酵速率和高级醇的产率和最终浓度，而不依赖于施加的背压。然而，高级醇的浓度取决于CO2浓度[1]。挥发性酯类是啤酒中风味物质的最大组分。酯类在啤酒中含量仅为痕量，但它们对风味谱极为重要。啤酒中的挥发性酯类可分为乙酸酯类和中链脂肪酸（MCFA）乙酯两大类。乙酸酯是啤酒的主要风味成分，因为它们的浓度远高于其他挥发性酯[5]。啤酒中最重要的酯类是乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、乙酸异丁酯和乙酸苯酯。乙酸乙酯的形成不受氮源影响，使其成为浓度最高的酯[12]。酯类气味阈值较低，乙酸异戊酯为0.2mg/L，乙酸乙酯为15～20mg/L[13-14]。酯在酵母中通过乙醇或高级醇、酰基辅酶A（主要是乙酰辅酶A）和酯合成酶的生化途径合成。方差分析证实，溶解CO2浓度对最大生长速率、最大和初始酯产率有显著的负面影响，并且这种效应比温度效应更明显[1]。在正常的啤酒发酵中，发酵温度越高，发酵副产物越多。一种补救办法是采用CO2的发酵罐背压。CO2压力升高，导致高级醇和酯的浓度降低，而邻位二酮和乙醛的含量增加[15]。最大的酵母生长速率和酯产率与超过2g/L溶解CO2浓度呈显著负相关[1]。研究表明，凡是有利于酵母旺盛发酵的工艺条件，都有利于酯类的形成[16]，相反，酯和高级醇的形成随着二氧化碳压力增大而减少，却主要是由于酵母生长的减少。然而，CO2对高级醇形成的影响比对酯形成的影响要小[3]。另一方面，酯类的产生与麦汁浓度有关，而高浓度麦汁中的酵母产生更多的乙酸酯类。这导致了啤酒风味的不平衡，是由产生的挥发性化合物的不成比例的水平引起的[17-18]。这也可称之为醇酯比失衡，研究证明，通过发酵醇酯比的合理控制，可以有效地控制啤酒风味质量的一致性和均一性[19]。1材料与方法1.1材料原料：啤酒大麦、啤酒花购自济南双麦有限公司；啤酒酵母SaccharomycescerevisiaeNCYC1108由海南大学生物综合实验室保存。试剂：正丙醇、异丁醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯，GR，阿拉丁试剂（上海）有限公司。仪器设备：顶空气相色谱HP6890N，细胞计数板。1.2实验方法麦汁制备：分别取20kg和25kg大麦芽粉碎，入100L糖化锅，加水80L，按45℃保温15min，52℃保温20min，63℃保温30min，72℃保温20min，再加热至78℃进行浸出糖化。麦汁过滤液合并加水55L，二次过滤液（洗糟）煮沸70min，煮沸10min时和煮沸40min时各加50g酒花。冷却，分别制得8°P麦汁和12°P麦汁各100L[20]。发酵条件：每个实验使用100L的两种浓度的麦芽汁（8°P和12°P），麦芽汁充氧直到接种前饱和。发酵罐的排气阀在接种后关闭，以产生背压。在整个发酵过程中，压力传感器控制背压分别保持在0、0.05MPa和0.15MPa，发酵在10℃下进行。每20h取样品，测定细胞数、麦汁密度和溶解CO2、总高级醇含量和总酯浓度。共测量10d。酵母活化：啤酒酵母菌株经复苏、琼脂平板划线挑取单菌落、接入20mL麦汁培养基,25℃培养2d。酵母加入装有经灭菌的1.5L8°P麦汁的3L锥形烧瓶中，用滤膜密封烧瓶，20℃轨道振荡扩培3d。接种前2h发酵温度降至10℃。高级醇和酯的检测：采用顶空气相色谱HP6890N（FID检测器）测定正丙醇、异丁醇、异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯。采用毛细管HP-NIONAX柱（30m×0.32mm×0.25μm膜厚）和顶空采样器HP7694E。实验条件如下：注入温度为225℃；柱温程序，在40℃下保持3min，然后以5℃/min升温到90℃；检测器温度，300℃；载气，氮气；载气流量，30mL/min；氢气流量，40mL/min；杨东升，李静，苏敏，李佳伟·二氧化碳背压对啤酒生成高级醇和酯的影响2525酿酒科技2019年第2期（总第296期）·LIQUOR-MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY2019No.2(Tol.296)空气流量，400mL/min；分流比，6∶1；样品瓶平衡温度50℃；平衡时间，30min；循环温度，60℃；传输线温度，65℃。工作站软件PG2070AA[21-22]。使用细胞计数板测定细胞数；溶解的CO2使用电位滴定仪测定；麦芽汁浓度采用锤度法测定[20，23]。2结果与分析2.1CO2背压对CO2浓度、酵母数量、总高级醇和酯的影响发酵方法如1.2部分所述，CO2背压对基本发酵特性的影响见图1—图8。结果表明，施加0.05MPa和0.15MPa的CO2背压显著减缓了酵母生长，降低了总高级醇的最终浓度和总酯生成，增大了溶解CO2的最终浓度。麦汁浓度并未明显影响CO2的增长趋势，这可能与CO2浓度达到饱和有关。主发酵前期，CO2压抑制酵母生长，生成CO2数量较少，主发酵后期，在发酵温度一致的情况下，CO2积累达到一定水平，压力越大，浓度越高（图1）。在本实验中，通过增大背压来减少酵母细胞生长。由图2可见，在主发酵前期，细胞生长曲线只是依照背压水平分组，麦汁浓度的影响不大。不仅最大细胞计数减少了45%，而且达到最大值的时间延长了40～60h（图2），同一酵母，较低发酵温度或较高CO2背压可以控制最大酵母数量。在实际生产中，采用背压工艺时可以选择性状优良的酵母作为生产菌株，以消除CO2对其生长代谢的影响。研究表明，细胞数量的减少导致较低的醇和酯浓度降低[24]。类似地，随着研究中细胞数量的减少，总醇含量和总酯含量下降。另一方面，总高级醇和总酯的最终水平不仅取决于CO2背压，也取决于麦汁浓度。12°P麦汁中总高级醇和总酯含量高于8°P麦汁（图1）。虽然目前8°P啤酒市场在美国市场占有率很高，但这种啤酒在欧洲市场仍然不被接受，因为淡啤酒被认为是清淡型的，主要是因为缺乏口感[25]。图3显示，在无背压情况下，8°P和12°P麦汁中总高级醇含量均在75h时达到最高值。在0.05MPa和0.15MPa背压情况下，8°P麦汁中总高级醇含量均在120h达到最高值，分别约为无背压最高值的50%和45%，12°P麦汁中总高级醇含量均在200h达到最高值，分别约为无背压最高值的70%和60%。由此可见，麦汁浓度控制高级醇的累加效应，CO2背压控制总高级醇最终生成量，控制效果是非常明显的。注：所有实验均在10℃下进行，A0=8°P,0MPa；A1=8°P,0.05MPa；A2=8°P,0.15MPa；B0=12°P,0MPa；B1=12°P,0.05MPa；B2=12°P,0.15MPa。以下所有图同。图1CO2浓度变化图图2酵母数量变化图图3总高级醇含量变化图2626主酵时常压发酵，双乙酰还原结束再升压，乙醛含量较低，酯含量较高[26]。这是一种提高酯含量的工艺方案。而提早升压，结果是相反的。图4显示，在无背压情况下，8°P和12°P麦汁中总酯含量均在100h达到最高值。在0.05MPa背压情况下，8°P和12°P麦汁中总酯含量分别在160h和180h达到最高值，分别约为无