反硝化聚磷菌种的反硝化吸磷特性研究焦中志

技术与研究反硝化聚磷菌种的反硝化吸磷特性研究焦中志李相昆张利成张杰(临沂市建设局)摘要:为了深入研究反硝化聚磷菌特性,采用平板分离技术,对实验室连续流双污泥系统缺氧反应器中的混合液分别在反峭化菌和聚磷菌培养基中进行分离培养和菌种鉴定,并对富集培养后的每株单菌分别进行反硝化吸磷效果试脸,最终筛选出同时其有反稍化吸磷能力的菌种.通过长期实验,得到明显具有反稍化效果的反梢化菌6株、聚磷菌9株,其中具有反稍化能力的有6株.吸磷试验发现,在分离出来的15株菌种中有11株菌在不同程度上具有反硝化吸磷能力.其中假单胞菌属的BJZ和产碱菌属的BJ3脱氮除磷效果最好,h8后磷的去除量分别为”.76略/L和11.85雌/L.从徽生物学的角度进一步脸证了同一菌种可以独立完成反峭化吸磷的任务,同时认为在厌氧/缺氧交替环境下反稍化聚磷菌是由具有反稍化能力的聚磷菌和具有吸磷能力的反峭化菌共同组成的.并可以确定在这些菌种中假单胞菌属和产碱菌属的部分菌种具有明显的反稍化除磷优势.关键词:反稍化戴聚磷菌;反稍化吸磷;平板分离聚磷和反硝化是污水生物除磷脱氮过程中两个十分重要的反应过程,随着除磷脱氮技术在微生物领域研究的不断深入,聚磷菌和反硝化菌也逐渐被人们认识和了解。有学者认为在传统的除磷脱氮工艺中,不动菌(Acz’net口bactor)是除磷菌中占优势的菌种〔卜4],假单胞菌(sPeu故珊osns)则是反硝化菌中占主导地位的菌种〔`一7]。在上世纪七十年代中期,uPhs和Chen(1975)等认为Acz’net口bactor绝不是唯一起主要吸磷作用的菌属,反硝化菌一定也承担部分吸磷的作用`8],随后osborn和iNhcol1s(1978)在研究除磷工艺中厌氧段投加硝酸氮对除磷的影响时也证实了这一观点〔9]。八十年代中期至今,反硝化吸磷现象己经被人们所确认【’叫6],并且J二gesnen等(1995)从微生物学角度也证实了同一菌种能够完成反硝化同时吸磷的任务,但是他同时也指出,聚磷菌中的Acz’netObactor并不具有反硝化能力`7],而且另有研究表明,在除磷脱氮工艺中Acz’netObactor在数量上也并不是最多的【卜,7,。目前普遍认为存在着两类除磷菌,即厌氧/好氧除磷工艺中的聚磷菌(以0)和在缺氧阶段利用内炭源(PHA)为底物和N0于为最终电子受体的反硝化聚磷菌(DN以0)`l8]。多年来,对于PAo的研究已经有很多,但是关于反硝化聚磷菌(DNPAO)群落结构和菌种的鉴定方面的研究却很少,国内关于这方面的研究更是在本世纪初才刚刚开始。Merozuki.Ml(999)〔冷20]在对厌氧/缺氧工艺中的聚磷菌群进行了研究后指出,在筛选出的一系列革兰阳性和阴性的反硝化菌中,一部分在好氧条件下表现出了吸磷特性。其中有两株菌月却叨bacter1’姗t,`介cz’esn和Aq傲sPjrz’11,dz’习阳I五既能利用氧又能利用N03一吸磷。关于反硝化菌中的其他一些菌种的生理特性也有报道,如几期coccusdeDjtrjfz’~在氧和N氏一同时存在时也能聚磷,但是必须有外加炭源的参与〔,卜22]。Ahn.J.A等(2002)利用PCR一民GE技术研究了DNPAO的菌群结构表明,PAO和DNPAO菌群有着明显的不同。同时从165rDNA的分析结果来看,一些菌种无论在好氧和缺氧条件下都能吸磷,如刀,乃刁etoabcterja〔16]。虽然反硝化菌中广泛存在具有吸磷能力的菌种,但是关于DNPOA除磷机理、菌群结构以及菌种鉴定方面的研究还有待进一步深入。本文目的是利用传统的平板分离技术,对实验室连续流双污泥系统〔s2]中缺氧池内菌种分别在硝化菌和菌磷菌培养集中进行分离,并对每株单菌富集后分别进行反硝化吸磷试验。1试验部分1.1试验材料与方法项目名称:北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室开放基金项目;山东省临沂市科委项目·260.沂蒙科技论坛论文选编反硝化菌分离培养基:每升蒸馏水加入5.09柠檬酸钠,1.09凡HP氏、1.09KHZOP。、ZgNK氏、0.29M邓氏·7H20和巧g琼脂粉,PH值控制在7.2~7.5。聚磷菌分离培养基:每升蒸馏水加入3.68gCH,C00Na·3肠O、28.73略aN撇04·2跳O、57.2加gNH;cl、131.82mgMgSO;·7压0、26.74m眯25氏、17.ZmgCaCI:·22H0、一2动EPSE缓冲溶剂、159琼脂和ZmL微量元素,pH7.0。微量元素构成:每升蒸馏水加入50gEDTA、sgFeSO;·7比0、1.6gCuSO;·5H20、sgMnC12·42H0、1.59(NH。)6Mo702;·4H20、50mgH3B03、10mgKI和50mgCoCI:.6H20。1.2分离与鉴定分离采用平板分离法l23]。对分离纯化后的菌株进行革兰氏染色、葡萄糖氧化发酵、接触酶、氧化酶等一系列生理生化实验,然后进行检索鉴定t24]。1.3吸磷试验分析方法将分离出来的反硝化菌和聚磷菌富集培养,在限磷培养液(P氏+3蕊m4盯)L中厌氧培养2h4,然后在富含磷和Ns0一的培养液中厌氧培养2h0以上,检测培养液中硝酸氮和磷的浓度变化。N压一采用庸香草酚分光光度法,P嘴一P,采用氯化亚锡还原光度法。2实验结果2.1菌种分离鉴定结果2.1.1反稍化菌的分离鉴定得到6株具有明显反硝化效果的反硝化菌,生理生化试验和检索结果表明,这些菌种分别属于弧菌科、肠杆菌科、假单胞菌属、肠杆菌科、气单胞属、微球菌属。2.1.2聚磷菌分离鉴定结果对缺氧池内的聚磷菌进行了二次分离,第一次采用了直接对活性污泥进行稀释、分离和纯化的方法,第二次采用先富集培养后分离的方法,两次共分得9株聚磷菌。其中JIL、JZL、J4L、LJS、J7L为第一次分得,JBI、BJZ、JB3、BJ4为第二次分得.生理生化试验和检索结果表明这些菌种分属于:葡萄球菌属、链球菌科、产碱菌属、产碱菌属、芽抱杆菌属、产碱菌属、芽抱杆菌属、假单胞菌属、产碱菌属、肠杆菌科。2.2硝化菌和聚磷菌的反硝化吸磷试验结果2.2.1反稍化菌的吸磷试验6株具有明显反硝化效果的反硝化菌吸磷试验结果如图1(a)“(f)所示。从图1(a)、(f)可以看出这6株反硝化菌在反硝化脱氮的同时都具有不同程度的吸磷能力。肠杆菌科的两株菌LB3、LBS,微球菌属的LgB和假单胞菌属的菌株BL4的吸磷能力较强,在前h8的吸磷量分别为1.7m4盯L、2.16m岁L、1.OmgL/和0.9m1以L,ZOh后的吸磷量达到了3.3m2岁L、4.6=m4g/L、2.49和2.74mgL/;弧菌科的菌株BLZ和气单胞菌属的菌株LBS的吸磷能力较弱在前sh的吸磷量仅为和0.42m以L和0.66mgL/,2h0后的吸磷量为lmg/L和1.24mg/L。””蝙’、\\\\州州卿.!二l卜\\\l2l0一今-PO今P~《》~NO3-N一山.的写侧锐~l0易渤钧气024681012141618加刀时间小0246810121416182022时间爪(a)BLZ吸磷试验(b)LB4吸磷试验技术与研究~今-代冷P月冬~NO斗N-l0协导鞠气-令-代捧P~心~NO斗N10宁矛却气0246810!214161820024时间小c()LB3吸磷试验6810!2】416182022时间爪d()LBS吸磷试验J峙,`nU....,..口d..且一争-代冲P叫}.NO斗N~今~代冷P~O~N03-N~挑一O哪朋,1.比.、侧锐0义-X-xeexwex-~.x-一-一-一---一一-一~l0.邢.感姻气0246810.12141618加刀时间瓜0246810!21416!8202224时间爪(e)LBS吸磷试验(0LBg吸磷试验图l反硝化菌反硝化吸磷效果2.2.2聚磷菌的吸磷试验试验中发现9株聚磷菌好氧吸磷能力都很强,但是通过生理生化试验发现只有JZL、J4L、J7L、BJZ、BJ3和JB46具有反硝化能力,而其中J4L菌株的扩大培养没有成功,其余菌株进行反硝化吸磷试验结果如图2(a)~(e)所示。从图2(a)~(e)可以看出这5株菌在反硝化的同时具有不同程度的吸磷能力。其中产碱菌属的两株菌BJ3、J7L和假单胞菌属的菌株JBZ的吸磷能力较强,前h8的吸磷量分别为n.85mgL/、1.49mgL/和13.76m岁L,20h后JL7和JBZ的吸磷量分别为2.24mg/L和14.34m盯L.邢曰矽.甸钩l210叫卜.代洲.P州斗-N0-3N-挑~01)仅刀-今~代洲.P州卜~NO斗N一ó.ao曰、侧说:氛。。一二0’“”肠搞对`’`”202224(a)JZL反硝化吸磷0246810121416182022时间/h(b)几7反硝化吸磷沂蒙科技论坛论文选编2724刀18一抽.瞥15泣泣一一一ō.日、侧锐澎说时间小时间爪242l小小尸令尸\\\\\\一阱PPP\\\一~~~一一\一~~~目目一、、(d)JB3反硝化吸磷一ō.日、侧说JB4时间币(e)JB4反硝化吸磷图2聚磷菌反硝化吸磷试验试验中发现20h后JB3发生了释磷现象,释磷量为n.52m岁L:链球菌科的菌株JZL和肠杆菌科的菌株BJ4的吸磷能力较弱,前h8的吸磷量分别为1.74m盯L和0.75m岁L,2h0后的吸磷量为1.74mgL/和0.glm岁L。3讨论试验中尽管采用了两种培养基,但分离出的菌种数量却还是十分有限的,没有以往试验中分离的菌种多,这可能主要是因为污泥取自双污泥系统的缺氧段,这部分污泥没有经过好氧过程,因此微生物的种类要教好氧污泥中的少。由反硝化吸磷试验发现,在分离得到的巧株菌中,除一株吸磷试验未做以外共有n株在不同程度上具反硝化同时脱氮除磷能力。得到的n株菌中,肠杆菌科的数量最多,为3株,占总数的27%:假单胞菌属和产碱菌属数量相等各2株,各占总数的1%8:其余的气单胞菌属、弧菌科、链球菌属、微球菌属各1株。而反硝化吸磷效果最佳的是假单胞菌属和产碱菌属。但是由这次的实验结果并不能得出哪个菌种是系统中的优势菌种,从而也不能证明缺氧池中假单胞菌和产碱菌属对反硝化吸磷贡献最大。这也是传统菌种分离技术的局限所在,同时利用此种方法,对于大多数菌种只能鉴定到属,甚至是科。但是我们可以肯定的是在双污泥系统的缺氧池中,反硝化聚磷菌是大量存在的,它是由具有反硝化能力的聚磷菌和具有吸磷能力的反硝化菌共同组成的。假单胞菌属和产碱菌属的部分菌种具有明显的反硝化除磷优势。4结论通过长期实验得到了如下结论:(1)实验得到的6株反硝化菌和9株聚磷菌,分别属于肠杆菌科、技术与研究·623·假单胞菌属、气单胞菌属、弧菌科、微球菌属、链球菌属和产碱菌属。有n株菌在不同程度上具有反硝化吸磷能力。在得到的反硝化聚磷菌中,假单胞菌属的菌株BJZ和产碱菌属的菌株JB3的脱氮除磷效果最好,h8后磷的去除量分别为13.7m6gL/和n.85mgL/;(2)从微生物学的角度验证了同一菌种可以独立完成反硝化吸磷的任务;(3)反硝化吸磷菌是由具有反硝化能力的聚磷菌和具有吸磷能力的反硝化菌共同组成的,假单胞菌属和产碱菌属的部分菌种具有明显的反硝化除磷优势。参考文献1.BuehanL(1980).Thelocationandnatureofaee娜latedphosphorusinaetivatedsludge.D.Se.Thesis,Univ.ofPretoria,SouthAfriea.2,BuehanL(1983).Possiblebiologiealmeehanismofphosphorusremoval.血t.Sei.Teeh.15,87一103.3.HoranNJ(1991)Biologiealawste帕tertreatmentsystems:Theoryandoperation.JohnWiley&SonLtd.England.220一223.4.StarkenburgwVan,RensinkJ’HandRijsGBJ(1993)Biologiea1P一removal:StateoftheartintheNetherlands.Wa