高效菌种的筛选及其在焦化废水中的应用研究朱芳

StudyofScreeningofHigh-efficientBacteriaandApplicationinCookingWastewaterTreatmentFangZHU1,SuqinLI2,ShimeiLUO1,LinglingZHANG1,GuohongXIONG1,31UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing,100083,China2KeyLaboratoryofEcologyandrecyclingmetallurgy,Beijing,100083,China3BeijingMILDScienceandTechnologyCo.LTD,Beijing100085,ChinaEmail:[e-mail],[e-mail],[e-mail]:Inthisstudy,bioaugmentationtechniquewasusedtoimproveCODremovalratebyaddinghigh-efficientbacteria.Afterdomestication,fivekindsofbacteriawerescreenedfromcokingwastewatersludge,whichhadstrongadaptabilityforthecokingwastewater.Amongthem,twokindsofbacteriashowedgoodsynergism,sotheywerechosenandmixedasdominantmicroflora.TheoptimumgrowthtemperatureandpHofhigh-efficientbacteriaweredetermined,andtheirgrowthcurveswerealsodrawn.Ontheoptimumcondition,theCODremovalratewas70.5%,anditcouldbeincreasedbyabout10%viaadddominantmi-crofloratonormalsludge.Keywords:cokingwastewater;bioaugmentationtechnique;high-efficientbacteria高效菌种的筛选及其在焦化废水中的应用研究朱芳1，李素芹2，骆诗梅1,张玲玲1,熊国宏1,31北京科技大学冶金与生态工程学院，北京，中国，1000832教育部生态与循环冶金重点实验室，北京，中国，1000833北京麦尔得科技有限公司，北京，中国，100085Email:[e-mail],[e-mail],[e-mail]摘要:本研究利用生物强化技术原理，通过投加高效菌种来提高降解COD的效率。经过驯化培养，从焦化废水污泥中分离出适应性较强的5株单菌，其中2个菌株间显示出良好的协同作用，作为优势菌群。并且对菌株的最佳生长温度、pH以及其生长曲线进行研究。优势菌群在适宜条件下，COD去除率可达70.5%。将优势菌群加入普通污泥中，COD去除率可提高约10%。关键词:焦化废水；生物强化技术；高效菌种1引言焦化废水是焦化厂焦炭生产、煤气净化和化学产品回收过程中各个工序产生的一种混合工业废水，有排放量大、成份复杂、难降解以及毒性大等特点。焦化废水呈深棕色，据报道所含溶解性有机物和无机物100多种，主要含酚、氰化物、苯、氨氮、焦油和硫化物等有毒有害物质，还含少量萘、吡啶、喹啉、吲哚、蒽、咔唑以及一些以盐类形式存在的无机物[1-2]。上述污染物的排放严重破坏了生态环境，甚至对人体健康造成极大的危害。目前绝大部分焦化厂使用生物法处理，处理后CODCr和NH3-N无法达到国家排放标准(GB8978-1996)[3]。而造成这一问题的主要原因是：1）处理系统中不存在能降解该类化合物的微生物或数量很少，由于受到其他生物的竞争、捕食，很难大量繁殖而发挥作用；2）环境条件如：营养物质、温度、pH、盐度、DO等不利于特定微生物发挥功能。相对而言，环境影响容易控制，而是否存在一定数量的特定微生物成了关键。生物强化技术就是针对这一点提出的。生物强化技术，即生物增强技术(Bioaugmentation)，它产生于本世纪70年代中期，80年代以来得以广泛的研究和应用。起初仅在生产事故时投加高效菌种，以改善水质，恢复系统正常生产。后来因为其抗毒性能力强、能提高对目标去除物的去除效果[4]、缩短系统启动时间[5]以及改善污泥性能、减ConferenceonEnvironmentalPollutionandPublicHealth978-1-935068-16-7©2010SciRes.1215少污泥产量[6]而被国外用于工业废水等高污染难降解有毒污染废水。目前，投菌法在德国、日本、爱尔兰等国已经投入工业应用[7-9]，国内对生物强化技术的研究起步较晚，因此大部分还停留在实验室阶段，实际应用还不广泛。现如今生物强化技术是指为提高废水处理系统的处理能力,而在此处理系统中投加具有特定功能的微生物、营养物或基质类似物[10]。其中的微生物可以是从自然界中经过驯化、富集、筛选、培养而得到的优势菌种，通常源于被废水污染的土壤中[11]或者污水处理厂的排水中[12]，也可以是通过基因组合技术得到的工程菌种[13]。2试验方法和材料2.1试验材料焦化废水和污泥均采自河北某焦化厂焦化废水处理段，焦化废水采自生化段前调节池，污泥采自污泥回流段。富集培养基：将牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g和NaCl5.0g溶于1L水中，并调节pH为7.0。选择培养基：将焦化废水与富集培养基按一定比例混合。固体培养基：在上述培养基中每升加入20g琼脂。2.2试验方法2.2.1菌株筛选方法污泥活化：取100ml污泥，加入900ml焦化废水与富集培养基为1:1的选择培养基闷爆24h，静置30min，倒出上清液，再加入选择培养基至1L，如此活化3个周期。驯化培养：取5ml污泥于50ml1:1的选择培养基中，在30℃、150r/min的摇床中培养，待培养基浑浊，微生物明显生长后，以10%的接种量转接入2:1的选择培养基,在上述条件下进行培养。每次转接都增加选择培养基中焦化废水的比例，直到全部为焦化废水。采用稀释涂布法分离焦化废水中的微生物。将单株微生物接至富集培养基中培养24h，作为待用菌种。菌落形态观察：用划线法将菌体接种于固体平板培养基上，于37℃恒温培养箱中培养24h后进行观察。生长曲线测定：取2.5ml菌种接种于50ml富集培养基中，于30℃、150r/min摇床培养，每两个小时测定全培养液在450nm波长处的吸光度，绘制生长曲线。2.2.2菌株降解特性研究将一定量菌体加入50ml焦化废水中，于30℃、150r/min的摇床中反应48h，全培养液在离心机4000r/min条件下离心30min将菌体和废水分离，废水用于CODCr测定。以COD的去除率作为评价指标。CODCr采用重铬酸钾法（GB11914-1989）进行测定[14]。3试验结果讨论3.1高效细菌的驯化与筛选3.1.1菌种的驯化培养按试验方法中菌种驯化方法进行驯化，经20d驯化后，选择培养液的成分全部为焦化废水，用显微镜观察，存在活体微生物，认为驯化完成。用稀释涂布法进行分离。分离出5个菌种，分别为1#、2#、3#、4#和5#菌。在驯化过程中，当选择培养基比例为7:1时，微生物浓度有明显下降的现象，说明在焦化废水中的有毒物质浓度已不适合大多数微生物正常生长，对微生物生长有明显抑制作用。3.1.2高效菌种的筛选取10ml1-5#摇床培养后的单菌全培养液在4000r/min条件下离心30min后，用去离子水洗涤一次，加入50ml焦化废水中，在摇床中进行反应，48h后测定COD，结果如图1：Figure1.CODremovalrateof5kindsofbacteria图1.5株单菌的COD去除率试验中焦化废水原水COD为503.63mg/L。从图1中可以看出，5个单菌对焦化废水COD的去除率均达到40%以上，3#效果最好，达到56.98%。同时将1-5#菌进行两两组合，每种单菌经摇床培养后各取5ml，组合后为10ml，与单菌相同的条件下进行反应，共十组，研究其相互间的协同或拮抗作用。结果如图2：ConferenceonEnvironmentalPollutionandPublicHealth978-1-935068-16-7©2010SciRes.1216Figure2.CODremovalrateofmixedbacteria图2.混合菌的COD去除率图2中可以看出，组合1+2、1+4、1+5和4+5的去除率都低于40%，说明出现了拮抗作用，4+5中COD的去除率出现负值，说明菌种之间不仅存在生长和活性抑制，还存在菌体大量死亡，胞内物质外泄。组合3+5的去除效率最高，略小于3#单菌，为55.27%，因此选择3#与5#作为本试验的重点研究对象。3.2高效菌种生长特性研究3.2.1菌落形态观察菌种在30℃、150r/min摇床培养24h后，用划线法接种于平板培养基，在37℃恒温培养箱中培养48h后进行菌落形态观察。观察结果如表1：Table1.Colonymorphologycharacteristics图1.菌落的形态特征菌落特菌征种序号形状颜色光滑度透明度与培养基结合程度1圆形红色光滑不透明易挑起2点状淡黄色光滑微透明紧密3圆形明黄色光滑不透明紧密4不规则白色不光滑不透明易挑起5圆形淡黄色光滑不透明紧密由菌落的特征来看，分离出的5个菌种明显为不同菌种，其他特性需进一步研究。3.2.2菌种生长曲线的测定根据试验方法所述，对3#和5#进行生长曲线测定，测定结果如图3：从图中可以看出，3#和5#前2h都为延迟期，2h以后进入对数成长期。3#约8h后进入稳定期，菌种数量增长减缓，持续一段时间后开始减少，在18h后进入衰亡期；5#约16h后进入稳定期，20h后进入衰亡期。根据分析可得，3#扩大培养时间为8h,5#扩大培养时间为16h。Figure3.Thegrowthcurveof3#and5#图3.3#和5#的生长曲线3.2.3温度对菌种生长的影响取5ml菌株接入50ml富集培养基中，pH为7，150r/min摇床培养，调节不同温度进行培养，3#培养8h、5#培养16h后测吸光度，研究菌种生长状况，结果如图4：Figure4.3#and5#growthunderdifferenttemperature图4.温度对3#和5#菌生长的影响从图中看出，3#菌对温度并不很敏感，在20℃到40℃的范围内可以很好生长，在35℃时生物量达到最大值。5#菌对温度的敏感度大于3#，在25℃到35℃之间可以很好生长，在35℃时达到生物量最大值。3.2.4pH对菌种生长的影响取5ml菌种接入50ml富集培养基中，在30℃、150r/min摇床条件下，调节不同pH进行培养，3#培养8h、5#培养16h后测吸光度，研究菌种生长状况，结果如图5：从图中可以看出，3#菌对pH的敏感度高于5#菌。3#菌在pH为6.5-8时均不受抑制；5#菌在pH为6-8.5范围内可良好生长；在pH为7时两种菌生长状况均为最好。ConferenceonEnvironmentalPollutionandPublicHealth978-1-935068-16-7©2010SciRes.1217Figure5.Thegrowthof3#and5#underdifferentpH图5.pH对3#和5#菌生长的影响3.3高效细菌降解特性研究3.3.1高效种群投加方式的确定不同投加菌种的方式对废水处理效果会有一定的影响。本研究对直接投加全培养液和离心后投加菌体、以及离心的不同条件进行对比，进水C