高效耐海水型厌氧氨氧化污泥的驯化

中国环境科学2015,35(3)：748~756ChinaEnvironmentalScience高效耐海水型厌氧氨氧化污泥的驯化李智行1,张蕾1*,陈晓波2,李航1,李旦1(1.大连海洋大学海洋科技与环境学院,辽宁大连116023；2.大连市市政设计研究院有限责任公司,辽宁大连116021)摘要：针对部分含海水废水生物脱氮效能较低的问题,研究了梯度盐度海水对淡水厌氧氨氧化污泥的驯化过程.考察了不同海水盐度对厌氧氨氧化反应动力学、厌氧氨氧化菌细胞形态和反应器中菌群变化的影响.结果表明,梯度盐度废水可以成功驯化淡水厌氧氨氧化污泥,通过145d的驯化,其总氮去除速率为2.80kgN/(m3·d).在海水盐度由0提高至10‰、20‰和30‰的过程中厌氧氨氧化反应速率经历了升高、降低、再升高的过程,其中,海水盐度20‰在淡水厌氧氨氧化污泥的驯化过程中是一个临界点.驯化后,厌氧氨氧化菌细胞结构更加不规则,并在细胞壁上出现了类菌毛状结构,经16SrDNAPCR扩增测序鉴定该优势厌氧氨氧化菌为“CandidatusKueneniaStuttgartiensis”.驯化前后反应器中细菌菌群也发生改变.关键词：厌氧氨氧化；海水；驯化；脱氮中图分类号：X703.1文献标识码：A文章编号：1000-6923(2015)03-0748-09Acclimationofahighly-efficientandseawatertolerantanammoxsludge.LIZhi-xing1,ZHANGLei1*,CHENXiao-bo2,LIHang1,LIDan1(1.DepartmentofMarineScienceandEnvironmentalEngineering,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China；2.DalianMunicipalDesignandResearchInstituteCO.,LTD,Dalian116021,China).ChinaEnvironmentalScience,2015,35(3)：748~756Abstract：Theperformanceofbiologicalnitrogenremovalintreatingseawater-containingwastewaterisnotsatisfying.Herewereporttheacclimationofafreshwater-originanaerobicammoniumoxidation(anammox)sludgebyusingseawaterwithincreasingsaltconcentrations.Nitrogenremovalperformance,morphologicalcharacteristicsanddominantstrainsofthebacterialcommunityinthereactorwereinvestigated.After145daysofacclimation,thisfreshwater-originanammoxsludgewasfullyadaptedtoseawater,withatotalnitrogenremovalrate(TNRR)reaching2.80kgN/(m3·d).Theanaerobicammoniumoxidizingratefirstincreased,thendecreased,andthenincreasedagainwhentheseawatercontentwasgraduallyincreasedfrom0‰to30‰.Aseawatercontentof20‰wasthecriticalpointduringtheacclimation.Intermsofmorphologicalcharacteristics,cellshapeoftheacclimatedanammoxbacteriawasirregularandpilus-likeappendagesweredevelopedonthecellwall.ChangeinthebacterialcommunitycompositionafteracclimationwasalsoobservedthroughDGGE.Thedominantanammoxstrainwasidentifiedas“CandidatusKueneniaStuttgartiensis”basedonthesequenceofthe16SrDNAgene.Keywords：anammox；seawater；acclimation；nitrogenremoval近年来,一些沿海城市为缓解淡水资源日益紧缺的现状,开始推行海水直接利用或混合利用的方法,将其作为市政用水进行冲厕、街道洒水等,导致城市污水盐度增加,引发市政污水处理厂处理难题.此外,许多行业废水,如水产养殖废水、海产品加工废水,其中也含有大量的海水,盐度较高,难于处理[1-3].因此,开发能够耐受海水的高效菌种尤为必要.这种耐受海水的菌种可来源于2种途径,一是海洋生物资源的开发,二是淡水污泥的海水驯化.第1种途径由于对地理等特殊条件的要求往往受限,第2种途径就显得尤为重要.厌氧氨氧化(anammox)工艺是一种近年来研究较多的新型生物脱氮工艺,该工艺依托自养型厌氧氨氧化菌,以氨为电子供体,亚硝酸盐为电子收稿日期：2014-07-31基金项目：国家自然科学基金资助项目(41106097);辽宁省高校杰出青年学者成长计划资助项目(LJQ2012065)*责任作者,副教授,[e-mail]3期李智行等：高效耐海水型厌氧氨氧化污泥的驯化749受体,产生N2.由于能同时去除氨和亚硝酸盐,无须外加有机碳源,且能够改善硝化反应产酸、反硝化反应产碱均需中和的情况,其运行费用可比传统生物脱氮工艺节省近40%[4].目前发现的厌氧氨氧化菌包括6个属,其中淡水环境中的厌氧氨氧化菌有5个属,海水环境中的厌氧氨氧化菌有1个属[5-6].众多学者采用添加NaCl模拟盐度废水进行了厌氧氨氧化工艺影响的研究.金仁村等[7]、Ma等[8]、Chen等[9]对淡水厌氧氨氧化污泥进行短期的盐度冲击,发现低浓度的盐(0,5,10g/LNaCl)可使厌氧氨氧化活性提高,而高浓度的盐(20,30,50g/LNaCl)则明显抑制厌氧氨氧化活性.Liu等[10]、Kartal等[11]、Windey等[12]对淡水厌氧氨氧化污泥进行长期的盐度驯化,发现通过梯度提高盐度淡水厌氧氨氧化污泥最终可适应高达30g/L的盐度环境,然而当盐度继续升高至30g/L以上,淡水厌氧氨氧化污泥受到可逆抑制.经盐度驯化后微生物群落发生演变,但优势厌氧氨氧化菌依然是淡水型厌氧氨氧化菌“CandidatusKueneniaStuttgartiensis”.然而由于海水本身成分复杂,包括多种有机和无机的、溶解态和悬浮态的物质,其含量约为30‰,其中各组分的含量相差悬殊,难以人工模拟[13].研究表明,不同类型的无机离子对厌氧氨氧化的抑制程度不一[7],而有机物同样会对厌氧氨氧化产生影响[14-16],但截止到目前,关于有机物对厌氧氨氧化作用机理的研究还比较少,无机物和有机物协同作用的研究更是未有报道,以往仅采用添加NaCl模拟盐度条件并据此展开的盐度对厌氧氨氧化影响的研究事实上并不完善,不能直接应用于含海水废水的实际处理.因此本研究针对含海水废水生物脱氮效率低的问题,期望通过梯度盐度海水驯化淡水厌氧氨氧化污泥,使其耐受海水盐度,并具有较好的脱氮效果.在研究过程中考察了不同海水盐度对厌氧氨氧化反应动力学、厌氧氨氧化菌细胞形态和反应器内菌群变化的影响.1材料与方法1.1试验装置及其运行有机玻璃制作的上流式厌氧反应器构型及流程如图1所示.该反应器有效容积9L(内径为95mm、高度为400mm),主体反应区添加无纺滤布为载体,反应器上方设三相分离系统,保证出水、产气和污泥有效分离.反应器主体外部利用水浴夹层保证反应温度为37℃,控制水力停留时间(HRT)为0.45d.反应器在本试验前已采用低盐模拟废水进行厌氧氨氧化菌富集,该反应器的总氮去除速率维持在1.35kgN/(m3·d)左右,通过优势菌群鉴定,反应器中的厌氧氨氧化菌为“CandidatusKuenenia”,为典型的淡水型厌氧氨氧化菌.出气出水填料恒温水浴进水图1反应装置流程示意Fig.1Schematicdiagramofthereactor试验采用梯度盐度海水对淡水厌氧氨氧化污泥进行驯化,在驯化过程中,保证不同盐度海水驯化初期进水基质浓度相近,且每个盐度下驯化时间相同,通过逐步提高进水基质浓度的方法提高总氮去除速率.同时通过对每个海水盐度下基质代谢动力学参数的比较考察不同盐度海水对厌氧氨氧化反应的影响.750中国环境科学35卷1.2模拟废水模拟废水中的溶剂是比例不同的自来水和盐度为30‰的砂滤海水混合液,保证混合液中海水盐度分别为0、10‰、20‰和30‰.基质NH4+和NO2-由NH4Cl和NaNO2按照一定比例提供.此外,该模拟废水中(g/L)还含有KH2PO40.01,CaCl2·2H2O0.00565,MgSO4·7H2O0.3,NaHCO31和微量元素浓缩液I、II各1.25mL[17].微量元素浓缩液I、II组成见表1[18].以NaOH溶液或盐酸溶液控制进水pH值在7.0~7.5.表1微量元素浓缩液的组成Table1Compositionoftraceelements微量元素浓度(g/L)EDTA5ⅠFeSO45EDTA15H3BO40.014MnCl2·4H2O0.99CuSO4·5H2O0.25ZnSO4·7H2O0.43NiCl2·6H2O0.19CoCl2·6H2O0.24NaMoO4·2H2O0.22ⅡNaSeO4·10H2O0.211.3厌氧氨氧化污泥比活性测定取一定量带载体菌体放入150mL灭菌血清瓶中,并加入NH4+-N和NO2--N浓度分别为5mmol/L和6.5mmol/L的20‰和30‰盐度海水营养盐溶液.向血清瓶中冲入高纯氩气20min,充分去除溶液和血清瓶中的氧气.血清瓶用橡胶塞密封紧密,外壁采用铝箔包裹后置于37℃恒温水浴中.每隔一定时间取样,测定NH4+-N、NO2--N、NO3--N浓度变化,计算污泥在不同海水盐度下的厌氧氨氧化活性.以不添加污泥的血清瓶试验为空白对照,每个海水盐度设3个平行样.1.4样品透射电镜观察从反应器中取污泥样,置于2.5%的戊二醛溶液中,4℃固定过夜,经0.1mol/L、pH7.0磷酸缓冲液漂洗后,再用1%锇酸溶液固定1~2h,继续用磷酸缓冲液漂洗.经过50%、70%、80%、90%、95%和100%五种浓度的乙醇溶液脱水处理后,用纯丙酮处理20min.接着,分别用体积比为1:1和3:1的包埋剂与丙酮的混合液处理样品1h和3h,最后用包埋剂处理样品过夜.将渗透处理的样品包埋起来,70℃加热过夜,即得到包埋好的样品.样品在Reichert超薄切片机中切片,获得70~90nm的切片,用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min,再用JEM-2000EX型透射电镜(日本JEOL公司)观察结果.1.5DNA提取、聚合酶链式反应(PCR)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)及测序将反应器在海水盐度为0和30‰阶段后期的污泥样品进行DNA提取及细菌通用引物扩增.采用上海生能博彩公司环境样品DNA提取试剂盒v2.2进行DNA提取,然后以细菌通用引物PRBA338f和PRUN518通过PCR扩增样品中细菌的DNA片段.反应条件为:94℃预变性10min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,进行30个循环;最后在72℃下延伸7min[17].将PCR产物在35%~65%的变性液梯度条件下进行DGGE,电泳条件为先在120V电压下预电泳