固相碳源脱氮同步去除壬基酚的试验研究

中国环境科学2017,37(8)：2915~2923ChinaEnvironmentalScience固相碳源脱氮同步去除壬基酚的试验研究王婷,孙佳宁,吴为中*(北京大学环境科学与工程学院,北京100871)摘要：采用一种基于PHBV研发的新型固相碳源NS,构建同步硝化反硝化脱氮生物反应器,同时探究常见的内分泌干扰物壬基酚(NP)在系统中的同步去除特性,并运用IlluminaMiSeq高通量测序和荧光定量PCR(qPCR)技术,对微生物群落进行解析.反应器运行效果良好,硝酸盐氮和氨氮去除率可分别达到96.18%和82.54%,出水COD平均浓度为27.48mg/L,壬基酚平均去除率为81.17%.高通量测序结果表明,Dechloromonas(脱氯单胞菌属)和Zoogloea(动胶菌属)等报道的具脱氮作用的菌属在无壬基酚条件下占据优势地位.加入壬基酚的条件下,菌种总数和α多样性降低.荧光定量PCR结果表明,系统中氮循环基因丰度较高,nirS基因丰度最大,而amoA基因丰度最低.进水中存在壬基酚的条件下碳源表面nirS基因丰度较低.关键词：固相碳源；同步硝化反硝化；壬基酚；微生物群落结构；功能基因中图分类号：X522文献标识码：A文章编号：1000-6923(2017)08-2915-09Simultaneousremovalofnitrogenandnonylphenolusingsolidphasecarbonsource.WANGTing,SUNJia-ning,WUWei-zhong*(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,PekingUniversity,Beijing100871,China).ChinaEnvironmentalScience,2017,37(8)：2915~2923Abstract：ThesimultaneousnitrificationanddenitrificationbioreactorsinthisresearchwerepackedwithanewtypeofsolidphasecarbonsourceNS,whichwasinventedbasedonPHBV.Theremovalrateofnitrogenandnonylphenol(NP)inthereactorwasinvestigated.IlluminaMiSeqhigh-throughputsequencingandquantitativePCR(qCPR)wereappliedtoanalyzethemicrobialcommunitystructureandfunctionalgenes.Theremovalratesofnitrateandammonianitrogenwere96.18%and82.54%,respectively.AverageCODconcentrationwas27.48mg/Lineffluent.TheaverageremovalefficiencyofNPwas81.17%.Theresultsofhigh-throughputsequencingillustratedthatthepreviouslyreporteddenitrifiersincludingDechloromonas,RhodocyclaceaeandZoogloeawerethedominantmicrobegenusonthesurfaceofsolidcarbonwhenNPwasnotadded.TheestimatedtotalnumberofbacteriaspeciesandαdiversitydecreasedafterNPwasaddedintheinfluent.AccordingtooutcomesofqPCR,functionalgenesofnitrogencyclehadrichabundanceinthebioreactor.AbundancesofnirSgeneandamoAgenewerethehighestandlowest,respectively.However,nirSabundancereducedwhenNPwasaddedintheinfluent.Keywords：solidphasecarbonsource；simultaneousnitrificationanddenitrification；nonylphenol；microbialcommunitystructure；functionalgenes水体富营养化是我国亟待解决的重大环境问题之一.2015年《中国环境状况公报》显示,在开展营养状态监测的61个湖泊(水库)中,有14个湖泊呈轻度和中度富营养状态[1],而氮、磷等营养元素的过量输入是导致水体富营养化的重要原因.我国污水处理厂出水氮素不达标现象普遍存在,这加剧了地表受纳水体的富营养化风险.除氮素外,内分泌干扰物(EDCs)污染的日益加重也引起了社会的广泛关注[2].其中壬基酚(NP)是一类有代表性的环境内分泌干扰物,主要来自洗涤纺织等行业中使用的表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚(NPnEO)的分解[3].研究表明,壬基酚可促使雄性鱼和蟾蜍表现出雌性特征[4],具有显著雌激素效应和生物毒性,被联合国环境保护署(UNEP)确定为27种优先控制的持久性有毒污染物之一[5].上海污水处理厂受纳水体中壬基酚浓度在收稿日期：2016-12-26基金项目：国家自然科学基金资助项目(51378021);国家水体污染控制与治理重大科技专项(2012ZX07102002)*责任作者,副教授,[e-mail]2916中国环境科学37卷41.1~370.0ng/L之间,而出水壬基酚浓度达到125~1140ng/L,显著高于地表水浓度[6].因此实现对污水处理厂出水的同步深度脱氮和壬基酚等内分泌干扰物的去除具有十分重要的意义.可生物降解聚合物作为一种新型外加固相碳源在脱氮工艺中的应用已被广泛研究,相较于传统液体碳源,固相碳源具有无毒无害和缓释有机物的特性,可有效控制碳源过量和二次污染,同时可以作为反硝化生物膜的优良载体[7-9].国内外学者在以天然纤维素或高分子聚合物为固相碳源的脱氮系统中探究了五氯酚[10],氯吡硫磷,氯氰菊酯[11]和对氯苯酚[12]等农药的去除特性,发现农药的去除过程中吸附和生物降解作用同时存在,5mg/L氯酚类农药去除率约为45%[10].目前利用固相碳源脱氮系统同步脱氮和去除壬基酚的研究鲜有报道.本研究采用基于PHBV研发的新型固相碳源NS,构建微曝气条件下的同步硝化反硝化生物反应器,并探究了固相碳源脱氮系统中壬基酚的同步去除效果.运用Illlumina高通量测序技术和荧光定量PCR技术,解析系统中微生物群落组成和氮循环基因丰度,探究有无壬基酚的情况下菌群和基因丰度的差异.本研究可为污水处理厂深度脱氮技术改造提供理论依据与技术指导.1材料与方法1.1生物反应器的构建、驯化与运行生物反应器采用上流式,主要部分为有机玻璃制成的圆柱体,内径5cm,出水口距反应器底部45cm.将基于PHBV研发的新型固相碳源NS和生物陶粒共混作为填料,按体积比1:3混合填充,填充高度为24cm.试验所用接种活性污泥取自清华大学中水站回流污泥池,具有较好的脱氮性能.静态驯化1~2周后,开始连续流实验.进水采用人工配水,NH4+-N、NO3--N和PO43--P浓度分别为5,10和3mg/L.使用甲醇溶液将4-壬基酚标准物配置成500mg/L的储备液,贮藏于-20,℃间隔3周更换储备液.在第113d开始加入壬基酚,进水壬基酚初始浓度为0.5mg/L,第155d提高至1mg/L,第196d提高至2mg/L.进水箱和反应器均用锡纸包裹以避免光的干扰作用.维持水力停留时间(HRT)为2h,总氮容积负荷为180gN/(m3·d),壬基酚容积负荷分别为6、12、24gNP/(m3·d),温度(28±2),℃曝气量控制在3~5mL/min.装置如图1所示.进水出水432156图1连续流反应器装置Fig.1Experimentalapparatusforcontinuoustestsreactor1.进水箱;2.蠕动泵;3.填料(固相碳源NS与陶粒按体积比1:3混合);4.生物反应器;5.气泵;6.出水箱1.2水质分析方法反应器连续运行期间,定期取反应器进出水过0.45µm滤膜后,测定氨氮、硝酸盐氮和COD浓度.氨氮、硝酸盐氮根据国环保局发布的标准方法,分别采用紫外分光光度法检测(岛津,UV-Vis2401紫外-可见分光光度仪),COD采用快速消解法比色法测定(WTW,phtoLadS6,CR3200).反应器溶解氧及温度使用便携式溶氧仪测定(WTW,AM39).壬基酚(4-NP)标准物购于Adamas公司.反应器进、出水中壬基酚采用固相萃取法(SPE)提取,采用SPE固相萃取装置(SUPELCO公司)和HLB固相萃取小柱(博纳生物,6mL,500mg).取水样500mL过0.45µm滤膜待测.依次用3mL二氯甲烷、3mL甲醇和3mL超纯水活化HLB小柱,然后以3mL/min流速使水样通过HLB小柱,再用6mL超纯水淋洗,减压抽干30min,最后用10mL二氯甲烷分两次洗脱,洗脱液在40℃以下用氮气吹干,用1mL流动相定容,过0.22µm滤膜到进样8期王婷等：固相碳源脱氮同步去除壬基酚的试验研究2917小瓶中待测[13].壬基酚采用高效液相色谱串联紫外检测器(HPLC-UV,岛津公司,10-ADVp)测定,所采用的液相色谱柱为迪马公司树脂反相色谱柱(250mm×4.6mm×5µm),流动相采用甲醇-水(体积比89:11),流速1mL/min,紫外检测波长225nm,柱温35,℃进样量20µL[14].出峰时间7.7min,回收率113%.1.3Illumina高通量测序分析和荧光定量PCR在壬基酚加入之前反应器稳定运行的第96d,以及壬基酚加入之后的稳定运行时期、全过程第226d,分别从反应器底部随机取一定质量的固相碳源和生物陶粒,超声震荡后悬浊液过0.22µm滤膜.将滤膜剪碎,使用微生物DNA提取试剂盒(博彩生物,上海)提取DNA.高通量测序及初步分析由北京美吉桑格生物医药科技有限公司完成,以16srRNA基因V3~V5区作为测序段,引物为515F(5‘-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R(5‘-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’),在0.03水平进行OTU聚类和物种分类分析.基于16srRNA基因和氮循环基因amoA、narG、nirS、nirK、nosZ基因进行荧光定量PCR实验,由微基生物(上海)有限公司完成,引物信息如表1所示.表1荧光定量PCR引物名称及序列Table1PrimersusedforQuantitativePCR引物名称名称引物序列(3’-5’)338FACTCCTACGGGAGGCAGCAG16srRNA518RATTACCGCGGCTGCTGGamoA-1FGGGGTTTCTACTGGTGGTamoAamoA-2RCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCnarG1960m2fTAYGTSGGGCAGGARAAACTGnarGnarG2050m2rCGTAGAAGAAGCTGGTGCTGTTnirScd3aFGT(C/G)AACGT(C/G)AAGGA(A/G)AC(C/G)GGnirSnirSR3cdGA(C/G)TTCGG(A/G)TG(C/G)GTCTTGAnirK1FGGMATGGTKCCSTGGCnirKnirK5RGCCTCGATCAGRTTRTGGnosZ2FCGCRACGGCAASAAGGTSMSSGTnosZnosZ2RCAKRTGCAKSGCRTGGCAGAA水质部分及荧光定量PCR部分数据统计分析采用软件SPSS.18.0.Illumina高通