光合细菌分离鉴定及其快速培养的研究

光合细菌分离鉴定及其快速培养的研究摘要:对能净化养殖水的光合细菌进行了研究,分离得到菌株B3,鉴定该菌为沼泽红假单胞菌(Rhodorse“domon。p以。tris)〕通过一系列的试验确定了菌株B3的最佳培养条件,实现菌株B3的快速培养,为菌株B3进一步的应用提供了理论上的依据。关键词:光合细菌;水产养殖;快速培养;研究1引言近年来我国水产养殖业的发展蒸蒸日上,但从长远来看将会面临由人为和自然造成的池塘老化,水质恶化,有机污染严重,致病微生物大量滋生,以致形成大量病害的危险。这些病害会造成巨大的经济损失L’一2〕,故改善水产养殖水域的水质状况已成为养殖业生产发展的关键技术和研究热点。光合细菌是一类能进行光合作用的有益细菌,广泛分布于水田、坑塘、湖沼、江河、海洋、活性污泥和土壤中[’l。光合细菌具有改善水质的能力,而且有较高蛋白含量,并能促进水产品的生长繁殖,故在水产养殖中具有广泛的应用前景。因此分离得到高效净化水产养殖水质的光合细菌,对我国的水产养殖有着重要的意义〔4了。2材料和方法2,1材料2.1.1菌种来源购得具有高效净化水产养殖的光合细菌菌液(深红色菌液)。2.1.2培养基分离培养基:乙酸钠3.09,丙酸钠0.39,NaCI0.59,NH;CI19,MgSO4·7HZO0.29,KZHPO4o·39,KH尹0;0.59,CaCI:0.059,MnCI:·4HZO0.0039,reso4·7HZo0.0059,酵母膏0.19,蛋白脉0.019,谷氨酸0.2x10一,g,HZO1000mL,琼脂209,pH7.2一7.4,121℃温度下高压灭菌30min。液体培养基:Mgso4·7HZo0.29,NH不119,NaZCO359,KZHpo40.59,NaCI0.59,蛋白陈1.59,H必1000mL,pH7.2,121℃温度下高压灭菌30min。碳源和电子供体:苯甲酸、柠檬酸钠、乳酸钠、乙酸钠、丙酸钠、甘油、丙酮酸、苹果酸、甲醇、甘露醇、硫代硫酸钠。2.2实验方法2.2.1缺氧条件的建立在分离纯化细菌过程中,采用双层培养基法;在将光合细菌转接到液体培养基过程中,则采用液体培养基注人厌氧管且仅留15一3mL的空间的方法。2.2.2光合细菌的分离纯化取上述深红色菌液,采用双层培养基平板法进行分离。通过观察,挑取红色单菌落,重复进行平板划线分离,得菌株B3。2.2.3菌落及菌体形态的观察观察双层培养基中菌落形态;用荧光显微镜观察(型号为OLYMPUSBX一50)菌体形态。2.2.4革兰氏染色试验试验方法详见《污染控制微生物学实验》图。2.2.5B3菌体DNA的提取及其G十Cmol%的测定B3菌体DNA的提取采用林万明的方法,G十Cmol%的测定采用热变性温度法囚。2.2.6碳源和电子供体利用试验在每支厌氧管中分别加人各种碳源和电子供体,然后接种B3进行光照培养,几天后观察其结果。2.2.7细菌鉴定参照上述试验结果,根据《伯杰细菌鉴定手册》籍缪儡毓黔进(8版)[v]和《常见细菌系统鉴定手册》川进行鉴定表1菌株B3对碳源和电子供体的利用情况2.2.8菌株B3快速培养条件的确定在不同的培养条件下,pH值、光照类型、光照时间、NaCI浓度、酵母膏浓度,确定光合细菌最佳生长条件。采用722型光栅分光光度计测定光合细菌的OD值。最大吸收波长的确定。以未接菌的液体培养基为空白对照,选择不同的波长(660,666,670,674,676,675,650,690nm)测定菌液的OD值。oD最大值所对应的波长为该菌的最大吸收波长图。光照类型对菌株B3生长情况的影响。采用白炽灯、日光灯、自然光3种光照类型对菌株B3进行光照培养,培养温度控制在(30士2)℃(以下的试验均控制在这个温度),pH值调节为7.2,然后测定菌株B3在48,%,144h的OD值,观察其生长情况。pH值对菌株B3生长情况的影响。调节液体培养基的pH值,分别为6.9,7.2,7.5,7.8,8.1,在白炽灯下光照,测定菌株B3的OD值,观察其生长情况。光照时间对菌株B3生长情况的影响。接种菌体后,分别在48,96,144,192,240h测定菌株B3的OD值,观察其生长情况。NaCI浓度对菌株B3生长情况的影响。配置分别含0.1%,0.5%,1.0%,2.0%,3.0%,4.0%NaCI浓度的液体培养基,对光合细菌进行适应盐浓度能力试验,经光照培养4d后,测定OD值,观察菌体生长‘清况[101。酵母膏浓度对菌株生长情况的影响。在液体培养基中加人酵母膏,使其质量分数分别为0.01%,0.03%,0.05%,0.08%,0.10%,0.15%,0.20%,0.25%,0.30%,0.35%。光照培养4d,测定On值,观察菌体生长情况[l]。3结果与讨论3,1细菌鉴定菌落:在分离培养基中菌株B3的菌落形态呈圆形,红色,表面光滑、湿润且凸起状;在液体培养基中菌株B3显深红色。菌体形态及染色:菌株B3菌体细胞呈杆状,稍有弯曲,卵圆形,大小为0.7一0.9林mx1.3一2.4协m,且为革兰氏阴性菌。菌体中G十c摩尔分数为65.6%。根据试验结果,查《伯杰细菌鉴定手册》(8版)和《常见细菌系统鉴定手册》,菌株B3鉴定为沼泽红假单胞菌扭人。己叩seu汉onzonasp‘ustris)。碳源和电子供体利用试验结果见表1。3.2菌株B3快速培养条件的确定3.2.1最大吸收波长的确定试验结果表明,菌株B3在678nm处具有最大碳源和电子供体柠檬酸钠乳酸钠乙酸钠丙酸钠甘油苯甲酸丙酮酸苹果酸甲醇甘露醇硫代硫酸钠菌株B3.2.2不同光照类型对菌株B3生长情况的影响将菌株B3分别置于白炽灯、日光灯、自然光下培养,菌株B3在3种光源下的生长情况,见图2。结果表明,在白炽灯下培养的效果优于日光灯,而在日光灯下培养的效果又优于自然光。3.2.3pH值对菌株B3生长情况的影响pH值对菌株B3的生长影响,见图3。试验结果表明,菌株B3适合于在微碱性环境中生长,且pH为7.2时生长最快。3.2.4光照时间对菌株B3生长情况的影响不同光照时间段的菌体B3的生长情况,见图4。回一一一一一一一一一一一一一一试验结果表明,当pH值为7.2时,菌株B3经过96h培养后的菌量较大,此后即使继续培养,其生长量无显著变化。定菌株B3为沼泽红假单胞菌(Rhodop、。ndomonaspalotri、)。(2)白炽灯、日光灯和自然光3种光照类型均能使菌株B3生长。利用白炽灯光照培养,经%h,菌株B3的OD值为0.485;利用日光灯光照培养,经1科h,菌株B3的OD值为0.262;利用自然光光照培养,经144h,菌株B3的OD值为0.215。因此,在实验室中培养菌株B3应采用白炽灯;在实际批量培养中采用自然光进行光照较经济。(3)结果表明,利用白炽灯进行光照,温度为30℃士2,pH值为7.2,培养时l司为96h,Naez浓度为0.5%一2.0%,酵母膏浓度为0.2%时,可视为菌株B3快速培养的最佳条件。3.2.5NaCI浓度对菌株B3生长情况的影响NaCI浓度对菌株B3生长的影响见表2。表2NaCI浓度对菌株B3生长的影响菌株代号n,U。lNaCI浓度/(%)102.03.04.0B3++++++++++++++注:“十十十”表示生长良好;‘十十”表示生长较好;“+”表示生长。由表2可以看出,NaCI浓度为0.5%一2.0%时,菌株B3生长良好,表明菌株B3具有一定的适盐性。3.2.6酵母膏浓度对菌株生长的影响酵母膏浓底对菌株生长的影响见图5。由图5可知酵母膏浓度为0.2%时,菌株B3繁殖速度最快。适合于实验室中菌种的快速培养。4结论(l)从购得的光合细菌中分离得到菌株B3,根据菌落及菌体形态特征、革兰氏染色、碳源和电子供体利用情况和G+Cmol%为65.6%等试验结果,鉴参考文献仁1」张玲华,邝哲师,陈薇,等.高活性光合细菌沼泽红假单胞菌培养特性初探「J」.华南师范大学学报(自然科学版).20()l(4):37一39.「2〕郭庆文,吉海平.紫色非硫光合细菌的研究「J].饲料工业,1994,15(3):36一39.「3〕刘如林.光合细菌及其应用「M〕.北京:中国农业科技出版社,1991.〔4」SawadaH.Photos邓。hetiebaet币ajnw,tetrealm即,厂J〕.FermentTeehnol,1997(55):311一316.〔5」马放,任南琪,杨基先.污染控制微生物学实验仁M」.哈尔滨:哈尔滨工业大学出版社,2002.「61程光胜,朱厚础,周方.分析微生物专辑「M」.北京:科学出版社,1988.「7」R.E.布坎南,N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册「M]3版/l中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》编译组译.北京:科学出版社,1984.〔s]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册LM].北京:科学出版社,2001.〔9」沈萍.微生物学实验汇M」.北京:高等教育出版社,2001.〔10」徐姗楠,邱宏端,林娟,等.紫色非硫光合细菌的分离鉴定及其功能研究「J」.福州大学学报:自然科学版,20以,32(2):246一251.