好氧条件下复合生物膜活性污泥反应器中的反硝化菌群结构

好氧条件下复合生物膜鄄活性污泥反应器中的反硝化菌群结构*方摇芳摇王淑梅**摇冯翠杰摇陈少华(中国科学院城市环境研究所,中国科学院城市环境与健康重点实验室,福建厦门361021)摘摇要摇以nirK和nirS基因为标记,利用PCR鄄DGGE技术研究了好氧条件下复合生物膜鄄活性污泥反应器中的反硝化群落结构。结果表明,样品中大部分nirK鄄反硝化菌都属于琢鄄变形菌纲中的根瘤菌目Rhizobiales,而nirS鄄反硝化菌则与茁鄄变形菌纲(包括红环菌目Rhodo鄄cyclales和伯克氏菌目Burkholderiales)及酌鄄变形菌纲(假单胞菌目Pseudomonadales)细菌相似。在nirK鄄及nirS鄄群落中均发现了未与已知菌群聚类的特殊序列。细菌的生长方式(生物膜或活性污泥)对反硝化群落结构有显著影响。这些结果将为生物膜鄄活性污泥复合工艺中的反硝化过程提供基础数据。关键词摇反硝化菌群落;功能基因;复合生物膜鄄活性污泥工艺;DGGE中图分类号摇X172摇文献标识码摇A摇文章编号摇1000-4890(2011)3-0430-08CommunitystructureofdenitrifyingbacteriainahybridAS鄄biofilmprocessunderaerobiccondition.FANGFang,WANGShu鄄mei**,FENGCui鄄jie,CHENShao鄄hua(KeyLaboratoryofUrbanEnvironmentandHealth,InstituteofUrbanEnvironment,ChineseAcademyofSciences,Xiamen361021,Fujian,China).ChineseJournalofEcology,2011,30(3):430-437.Abstract:ByusingnirKandnirSasthemarkers,andwiththemethodsofPCRanddenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE),thispaperstudiedthecommunitystructureofdenitrifyingbacteriainahybridAS鄄biofilmreactorunderaerobiccondition.Inthesamplescollected,mostofnirK鄄containingdenitrifierswerebelongedtotheknownRhizobialesbacteriaof琢鄄proteobacteria,whilethenirS鄄containingdenitrifiersweresimilarto茁鄄proteobacterium(RhodocyclalesandBurk鄄holderiales)and酌鄄proteobacterium(Pseudomonadales).SomespecificsequenceswerefoundinnirS鄄andnirK鄄denitrifyingcommunities.Thedataalsodemonstratedthatthegrowthpatternsofbacteriainbiofilmoractivatedsludgecouldmakeasignificantshiftonthedenitrifyingcommunitystructure.Theseresultswouldprovidefundamentalinformationfortheunderstandingofthedeni鄄trificaitoninthehybridAS鄄biofilmprocessunderaerobiccondition.Keywords:denitrifyingcommunity;functionalgene;hybridAS鄄biofilmprocess;DGGE.*国家自然科学基金项目(50778156)和国家科技支撑计划项目(2009BAC57B02)资助。**通讯作者E鄄mail:[e-mail]收稿日期:2010鄄09鄄09摇摇接受日期:2010鄄12鄄19摇摇现阶段,超过80%的污水生物处理工艺都基于活性污泥反应器,但随着有机物和水力负荷的增加以及公众环保意识的增强,越来越多的国家和地区都制定了更为严格的排放标准,传统的活性污泥处理工艺常常不能达到排污要求,污水处理领域急需新的处理工艺,复合生物膜鄄活性污泥反应器就是其中之一(Nicolellaetal.,2000;Tizghadametal.,2008)。复合生物膜鄄活性污泥工艺指在曝气池中投加各种能提供微生物附着生长表面的载体,利用载体容易截留和附着生物量的特点,使曝气池中同时存在附着相和悬浮相生物(Wangetal.,2000)。由于复合工艺中生物膜自身的结构特点以及氧扩散的限制,生物膜由外向内,可以形成好氧区鄄缺氧区鄄厌氧区,同时生物膜的脱落可以使部分厌氧区的微生物进入活性污泥的好氧环境,生物膜的附着过程也可以使一部分好氧环境中的微生物进入缺氧/厌氧环境。由此可见,复合工艺中同时拥有微生物悬浮和附着生长2个系统的优点,为各种与脱氮有关的微生物菌群提供了合适的生存环境。研究发现,在生态学杂志ChineseJournalofEcology摇2011,30(3):430-437摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇复合工艺系统中明显发生同步硝化反硝化过程(Junetal.,2005;Seethaetal.,2010)。而在活性污泥反应器中投加载体也能够提高系统总生物量(赵庆良等,1999;赵庆良和黄汝,2000;Wangetal.,2000)。但到目前为止,针对复合生物膜鄄活性污泥工艺中反硝化菌群结构的研究还很有限,这阻碍了复合生物膜鄄活性污泥工艺中氮去除过程机理的研究。因此,深入调查该工艺中反硝化菌群结构特征是研究该工艺条件下同步硝化反硝化机理的重要内容。具有反硝化功能的微生物分布非常广泛,与系统分化无关,因此16SrRNA不适合分析环境中的反硝化群落(Parketal.,1997)。利用反硝化功能基因分析环境样品中的反硝化群落成为目前的研究趋势。在反硝化过程中,氮氧化物作为电子受体产生能量,整个过程由4个独立的酶作用:硝酸还原酶(nitratereductase,Nar)、亚硝酸还原酶(nitritereduc鄄tase,Nir)、一氧化氮还原酶(nitricoxidereductase,Nor)及氧化亚氮还原酶(nitrousoxidereductase,Nos)(Zumft,1992)。这些酶依次发生作用,最终将硝酸盐中的氮还原为N2分子。事实上,大部分完成反硝化的第一步骤———硝酸盐还原成亚硝酸盐的硝酸盐呼吸菌都不能进行反硝化反应,而且,一些反硝化细菌不能利用硝酸盐呼吸,但却能从亚硝酸盐开始进行反硝化作用。因此,硝酸还原酶不作为反硝化过程的标志酶。对于反硝化过程主要考虑后3种酶作用的反应。N在反硝化过程的第二步由NO-2转变为NO,由液相转移到气相,因此,亚硝酸还原酶是反硝化过程中的关键酶。亚硝酸还原酶因酶结构不同分为2种:cd1鄄亚硝酸还原酶和Cu鄄亚硝酸还原酶,分别由nirS和nirK基因编码。到目前为止,利用功能基因分析反硝化细菌群落已经成功应用于海洋沉积物、森林及农田、土壤、污染的地下水以及各类水处理反应器等领域(Priem佴etal.,2002;Avrahamietal.,2002;Nogalesetal.,2002;Yanetal.,2003;Tsunedaetal.,2005;Desnuesetal.,2007)。本文借助PCR鄄DGGE技术,分析悬浮相及附着相中能编码亚硝酸盐还原酶的反硝化细菌的种群结构,探讨在好氧条件下,复合工艺中不同生长方式的污泥及活性污泥反应器不同溶解氧浓度条件下是否存在反硝化群落,并揭示该条件下反硝化菌群结构的基本面貌,为复合工艺脱氮机理研究提供基础数据。1摇材料与方法1郾1摇样品采集污泥样品取自实验室复合生物膜鄄活性污泥反应器好氧池及平行运行的活性污泥反应器。复合生物膜鄄活性污泥反应器及活性污泥反应器的工艺流程(图1)、反应器尺寸和操作条件完全相同,不同之处在于复合工艺反应器好氧池中装填辫帘式软性填料。为研究好氧条件下的反硝化菌群及反硝化能力,反应器条件均设定在好氧条件下,2个好氧池中的区别为DO不同。反应器设计以城市污水为处理对象,接种污泥为市某污水处理厂的二沉池回流污泥。运行期间混合回流比为100%,污泥回流比为30%。2个反应器的主要运行参数如下:HRT=10~12h,SRT=15~20d,pH=7~8。复合工艺好氧池B中DO=5~6mg·L-1,活性污泥工艺好氧池B中DO=5~6mg·L-1,好氧池A中DO=1~2mg·L-1。取样当天反应器已稳定运行3个月,进水采用某小区的生活污水,当天进水水质:COD=375mg·L-1,NH+4鄄N=44郾25mg·L-1,TN=53郾25mg·L-1,复合生物膜鄄活性污泥反应器出水水质:COD=28郾6mg·L-1,NH+4鄄N=0郾08mg·L-1,TN=14郾71mg·L-1,活性污泥反应器出水水质:COD=63郾0mg·L-1,NH+4鄄N=0郾08mg·L-1,TN=22郾32mg·L-1。样品编号为:活性污泥反应器好氧池B活性污泥样品(W1);活性污泥反应器好氧池A活性污泥样品(W2);生物膜鄄活性污泥复合反应器好氧池B中活性污泥样品(W3);生物膜鄄活性污泥复合反应器好氧池B中生物膜污泥样品(W4)。其中活性污泥样品为污水沉淀离心后获得;生物膜污泥样品则用无菌小刀从生物膜上刮下获得。1郾2摇研究方法1郾2郾1摇DNA提取摇利用E.Z.M.A.土壤DNA提取试剂盒(美国Omega生物技术公司)对污泥总DNA进行提取。然后用0郾8%的琼脂糖凝胶电泳检测。图1摇复合生物膜鄄活性污泥反应器工艺流程Fig.1摇SchematicdiagramofhybridAS鄄biofilmprocessinthisstudy134方摇芳等:好氧条件下复合生物膜鄄活性污泥反应器中的反硝化菌群结构获得的DNA储存于-20益冰箱。利用微量紫外可见分光光度计(NanodropND鄄1000)测量样品在260和310nm的吸光值,然后根据公式计算DNA的浓度,计算公式为:[DNA]=50伊(OD260-OD310)1郾2郾2摇PCR扩增摇选择cd3bF(5爷-GTGAACGTSAAGGARACSGG鄄3爷)和R3cd(5爷鄄GASTTCGGRTGSGTCTTGA鄄3爷)作为扩增nirS基因的引物对;选择F1aCu(5爷鄄ATCATGGTSCTGCCGCG鄄3爷)和R3Cu(5爷鄄GCCTCGATCAGRTTGTGGTT鄄3爷)作为扩增nirK基因的引物对(Throb覿cketal.,2004)。为保证DGGE试验的顺利进行,在引物R3cd和R3Cu的5爷端均加上一段33bp的GC夹(5爷鄄GGCGGCGCGCCGCCCGCCCCGCCCCCGTCGCCC鄄3爷)(Throb覿cketal.,2004)。PCR总反应体系为25滋l,包括10伊PCRbuffer(750mmol·L-1Tris鄄HCl,pH8郾8,at25益,200mmol·L-1(NH4)2SO4,0郾1%Tween鄄20)2郾5滋l,每种脱氧核苷酸(dNTP)200滋mol·L-1,MgCl2浓度2郾5mmol·L-1,TaqDNA聚合酶1郾5U,nirS基因引物浓度为1郾0mmol·L-1,nirK基因引物浓度为0郾2mmol·L-1,以上试剂均使用美国Fermentas公司产品。样品DNA10鄄100ng。nirS基因和nirK基因PCR反应条件均为:94益,预变性2min,35个循环为94益(30s),57益(1min),72益(1min),最后在72益下延伸10min。扩增后的PCR产物用1郾2%