pEASYT1载体

pEASY®-T1CloningKit目录号：CT101试剂盒组成1.pEASY-T1CloningVector(10ng/μl)2.ControlTemplate(5ng/μl),ControlPrimers(10μM),3.M13F(10μM)，M13R(10μM)4.Trans1-T1PhageResistantChemicallyCompetentCell.保存Trans1-T1PhageResistantChemicallyCompetentcell可于–70℃保存至少六个月,其他组分-20℃保存至少六个月。产品说明pEASY-T1CloningKits适用于TA克隆.-快速克隆基因，仅需要5分钟反应时间。-提供氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。-对照插入片段克隆效率可达95%以上。-包含LacZ基因，在含有IPTG，X-gal的平板培养基上，可进行蓝白斑筛选。工作原理pEASY-T1CloningKits以线性的形式提供:-3′端悬垂胸腺嘧啶(T)可用于TA克隆-拓扑异构酶与载体相互偶联（活化载体）TaqDNA聚合酶具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的功能，可在新合成双链产物的3’端加上一个碱基。尽管4种碱基均可被聚合到3’端，但Taq酶对dATP的聚合能力远高于其他3种dNTP.所以，在标准PCR条件下，PCR产物3’端这一非模板依赖的聚合碱基几乎总是A。pEASY-T1CloningKits在3’端提供一个悬垂的T碱基，这样的结构使PCR片段可以高效的和载体进行连接。牛痘拓扑异构酶I型可以与DNA双链的特定位置结合并切割特异位点5’-(C/T)CCTT-3’,与3‘T的磷酸基团性成共价键，并切断其中一条DNA链，使DNA解链。磷酸二酯键断裂释放的能量储存于3’磷酸与拓扑异构酶氨基酸残基（Tyr-274）形成的共价键中。PCR产物5‘端羟基可以攻击形成的共价键使其断裂，释放拓扑异构酶，介导片段与载体的连接。操作方法•扩增目的条带•配置连接体系（加入载体和片段）•室温孵育5分钟•转化感受态细胞•选择白色或是淡蓝色的克隆进行鉴定注意！1.引物5’端不能磷酸化。2.扩增使用Taq系列DNA聚合酶。3..扩增反应后设置5-10分钟后延伸步骤，以保证产物的完整及聚合酶加A效率。4.扩增产物必须经过琼脂糖胶电泳检测。反应体系配置试剂使用量新鲜PCR产物0.5–4μLpEasy-T1Cloningvector1μL补足水至5μL1.轻轻混合，室温(20℃-37℃)反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。2.转化感受态细胞。注意！1.如不进行后期转化试验，连接体系可以储存于-20℃。2.推荐使用1μL载体3.最佳载体与片段摩尔比为1：7（在载体为1μL的情况下，可以粗略的按照“1Kb长度的片段需加入20ng的比例计算。如1Kb加入片段20ng、1.5Kb加30ng等）4.推荐使用3-5μL的反应体系。5.最佳反应时间①片段大小为0.1-1Kb（含1Kb）：5-10min②片段大小为1-2Kb（含2Kb）：10-15min③片段大小为2-3Kb（含3Kb）：15-20min片段为胶回收产物，反应时间取最大值。延长连接时间可以使克隆数目有所增长，但反应时间不能多于30min。6.最佳反应温度：25℃，若片段是高GC结构，可以37℃反应。（推荐用PCR仪控温）转化Trans1-T1CompetentCells1.加连接产物于50μlTrans1-T1感受态细胞中（在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴20-30分钟。2.42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。3.加250μl平衡至室温的SOC/LB，200转，37℃孵育1小时。4.取8μl，500mMIPTG，40μl，20mg/mlX-gal混合，待IPTG，X-gal被吸收后，取200μl菌液铺板，培养过夜（为得到较多克隆，4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）。阳性重组子的鉴定和测序PCR方法分析阳性重组子1.挑选白色克隆至10μl无菌水中，涡旋混合。2.25μl反应体系中取1μl混合液用作PCR反应的模板，用M13正向引物和反向引物鉴定重组子。3.PCR反应条件：94℃预变性10分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸（根据片段的大小确定延伸时间）30个循环，72℃后延伸10分钟。确认包含重组子的克隆，扩大培养，用M13F，M13R引物测序。4.若载体自连，通用引物扩增，自连带大小为199bp。限制性酶切分析阳性重组子1.挑选白色克隆接种于LB/Amp+或LB/Kan+的液体培养基中，过夜培养。2.提取质粒DNA3.，选择适宜的限制性内切酶，酶切鉴定重组子。测序用M13F，M13R，T7promoter引物测序，进行序列分析。注意！1.根据PCR产物的强弱，增减PCR产物的量(0.5-4μl)，但是载体使用量不变。2.反应时间绝对不能超过30分钟。3.总反应体积不能超过5μl。4.随着克隆片段的增加(3kb)，克隆效率降低。5.若有引物二聚体，建议使用PCR纯化试剂盒；紫外照射不仅容易使DNA发生突变，而且影响克隆效率。克隆常见问题分析克隆效率低影响克隆效率有许多因素，如扩增目的基因所用引物，基因的结构，插入片段和载体的比例等。如发现克隆效率低，尝试用下列方法提高克隆效率。a.纯化PCR产物。b.如插入片段的浓度太低，增加插入片段的量。c.用新鲜的PCR产物，不要冷冻PCR产物。由于3'-A热力学不稳定，产物应放置在4℃，并在1-2天内完成克隆反应。d.使用能产生3'末端“A”的DNA聚合酶。PCR鉴定重组子失败1.当用PCR方法鉴定重组子，没有得到目的扩增产物，又没有载体自连，说明PCR反应失败。重新优化PCR反应条件或提取质粒，以质粒作模板扩增或酶切鉴定包含重组子的克隆。2.重组克隆呈现淡蓝色或“fisheye”插入片段没有影响lacZ基因读码框，或插入片段太小，这种情况下菌落呈现淡蓝色，可以进行下游实验。对照片段（700bp）PCR体系ComponentsVolumeFinalConcentrationControlTemplate1μlasrequiredControlPrimers(10μM)1μl0.2μM10×Buffer(Buffer含Mg2+)5μl1×2.5mMdNTPs4μl0.2mMEasyTaqDNAPolymerase0.5μl2.5unitsddH2Otofinalvolume50μlNotapplicablePCR循环94℃2-5min94℃30sec50-60℃30sec30cycles72℃1kb/min72℃10min