质粒DNA的提取及检测实验报告

四川大学实验报告1/9题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。二．实验原理1.质粒(Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。3.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/LNaOH，2%SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性四川大学实验报告2/9（3）溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。三．实验材料及设备1.实验材料：（1）含质粒pUC18大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）；（2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。实验设备：2.实验仪器：（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；四川大学实验报告3/9（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。3.实验试剂：（1）质粒的提取a.LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5;b.溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ；c.氨苄青霉素(50mg/mL)；d.抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。e.无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。f.70%乙醇作用：纯化质粒DNA。g.TE缓冲液或ddH2O作用：溶解DNA（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测四川大学实验报告4/9a.Goldview（DNA染料）b.1×TAE缓冲液c.上样缓冲液（6×）四．实验方法及步骤1.质粒DNA的提取a)将带有质粒pUC18的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），370C培养过夜；b)取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液；c)加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min；d)加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min；e)加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min；f)10000rpm×5min，取上清液于另一干净的离心管中；g)向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm×10min，将上清液转移至新的离心管中；四川大学实验报告5/9h)加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm×2min,取上清液于新离心管中；i)向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h；j)12000rpm×5min，倒去上清液，吸干液体；k)加800μL70%乙醇，离心12000rpm×1min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味；l)加20μLddH2O，混匀使DNA溶解完全，取5μL做电泳检测，剩余的溶液放置-200C保存备用。2.DNA琼脂糖凝胶电泳检测a)琼脂糖凝胶板的制备b)称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解;c)待胶液冷却到650C（不烫手为宜），加入1μLGoldview混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内,静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子;3.加样四川大学实验报告6/9胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL上样缓冲液（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内。4.电泳将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。5.观察和拍照将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。五．实验结果四川大学实验报告7/9图1碱裂解法提取pEGFP-N3与pET-28A-c质粒凝胶电泳紫外荧光检测结果说明：从左到右依次为：pEGFP-N3、pET-28A-c、DL15000Maker所提取的质粒DNA可通过琼脂凝胶电泳进行检测。一般情况下，提取的质粒为3条带。在细胞内，质粒DNA是共价闭合环状DNA，常以超螺旋形式存在；如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA；若两条链在同一处或相近的部位断裂，则变成线性DNA分子。在电泳时，同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其速度MarkerpET-28a-cpEGFP-N3A带：15000bpD带5000bpB带10000bpC带7500bpF带1000bpG带250bpE带3000bp四川大学实验报告8/9从大到小的次序为：cccDNA线性ocDNA，共价闭环DNA的泳动速度最快，电泳速度最快的条带显色最深。但在优化条件下，如在冰浴中或使用试剂盒提取时，可以只出现一条带或主要出现一条带，即超螺旋带。由图可知，本次实验结果出现了明显的三条带，表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。与Marker比照，分子量基本符合对应的分子量条带。实验结果较好。六．结果讨论与结论：1.实验结论：通过碱裂解方法，我们将细菌的质粒变性提出，又通过多个洗涤、纯化步骤，得到了提纯的质粒，在最后的本次实验结果出现了明显的三条带，表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。与Marker比照，分子量基本符合对应的分子量条带,实验结果较好。2.讨论一：溶液II为什么现配现用？而且需放置在常温下？答：溶液中NaOH放置过久会与空气中CO2反应变质，导致溶液ⅡpH下降，无法达到很好的裂解效果；溶液中SDS成分在温度较低环境下由于溶解度下降导致析出，溶液失去效果。3.讨论二：抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇）的作用。氯仿：四川大学实验报告9/9异戊醇为什么加两次？作用：使样品中杂质蛋白变性析出，被抽提出样品；第二次加入异戊醇目的为洗净上一步抽提中样品残留的饱和酚。4.讨论三：实验中无水乙醇与70%乙醇的作用。用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂.DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合；70％乙醇的作用不是沉淀DNA，而是通过漂洗上一步得到的沉淀，使沉淀中的盐溶解，从而进一步纯化DNA。5.讨论四：电泳检测中忘加指示剂会出现什么情况？拔梳子和点样步骤的注意事项。如果没有指示剂，则无法准确追踪电泳的进度。容易导致电泳不足或者过度。拔梳子时，应当动作轻缓，轻微左右摇晃使梳子缓慢脱出。注意不要前后摇晃，导致跑胶起点不一或者胶板变形。点样时，枪口要深入凹槽底部，但又不能使枪口触碰挤压胶板。