色谱过程

色谱过程色谱过程是物质分子在相对运动的两相间反复分配“平衡”的过程。混合物中，若两个组分的分配系数(distributioncoefficient)不等，则产生差速迁移，而被分离色谱过程方程tR=t0(1+KVs／Vm)=t0(1+K/b)=t0(1+k)第十九章经典液相色谱法在液相色谱中，按照固定相的规格、流动相的驱动力、柱效和分离周期的不同，又有经典液相色谱法和现代液相色谱法之分。现代液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上发展起来的。经典柱色谱法是将普通规格的固定相装于管径较大的柱管内构成色谱柱，常压输送流动相，以重力和毛细管作用力为驱动力，一般不具备在线检测器。与现代柱色谱法(如高效液相色谱法)相比，经典柱色谱法分离周期比较长，柱效比较低。目前通常作为分离手段使用，如中草药有效成分的分离纯化、不同分子量的蛋白质或多肽的分离及去离子水的制备等。平板色谱法：色谱过程在固定相构成的平面层内进行的色谱法•薄层色谱法(TLC)：固定相是涂铺在玻璃、金属或塑料薄板的光洁表面上•纸色谱法：以滤纸作为固定液的载体•薄膜色谱法：将高分子固定相制成薄膜。经典平板色谱中流动相(展开剂)的移动主要靠固定相的毛细管作用力，有时还靠重力。平板色谱法的特点：•仪器设备简单•费用低•分析速度快•能同时分析多个样品•对样品预处理的要求不高•试样不受沸点、热稳定性的限制。因此，平板色谱法广泛应用于医药工业中产品的纯度控制和杂质检查、天然药物研究中有效成分的分离、中药的定性鉴别、临床实验室和生物化学中各种样品的分析。由于平板色谱与柱色谱(包括高效液相色谱)具有相同的分离机制，因此，它常可用作柱色谱条件选择的参考依据。第二节经典柱色谱法主要讨论•液一固吸附柱色谱法•离子交换柱色谱法。一、液一固吸附柱色谱法(一)分离原理固定相是固体吸附剂的液相柱色谱法称为液一固吸附柱色谱法。吸附(adsorption)是溶质在吸附剂表面的集中浓缩现象。吸附剂一般是多孔性微粒状物质，具有较大的比表面积，在其表面有许多吸附中心。这些吸附中心的多少及其吸附能力的强弱直接影响吸附剂的性能。例如，常用吸附剂硅胶表面的硅醇基(SiOH)为吸附中心，对不同极性的物质具有不同的吸附能力。通常极性强的组分的K值大，易被吸附剂所吸附，随流动相向前移行的速度小，保留时间就长，即后流出色谱柱。(二)吸附剂的性质1.硅胶硅胶是最常见的吸附剂，通常用SiO2xH2O表示，是具有硅氧交联结构。表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是使硅胶具有吸附力的活性基团，由于其能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而具有吸附性，它们以三种形式存在于硅胶表面：吸附力大小顺序：III＞I＞II分配色谱狭义分配系数(K)mmssmsVXVXCCK//kK吸附色谱吸附系数(Ka)Xm＋nYa＝X+nYmnnnKmmaaYXYXKa=[Xa]／[Xm]=(Xa／Sa)／(Xm／Vm)离子交换色谱选择系数(Ks)Ks=[RX+]／[X+]空间排阻色谱渗透系数(Kp)Kp=[Xs]／[Xm]1001101201301401501601701801902007891011121314151678910111213141516吸附力大小顺序：III＞I＞II多数活性羟基存在于硅胶表面较小的孔穴中，因而表面孔穴较小的硅胶的吸附性能较强硅胶中水的作用水能与硅胶表面羟基结合成水合硅醇基而使其失去活性。但将硅胶加热到100ºC左右，该水能可逆地被除去，故将此水称为自由水。硅胶的活性与含水量有关(表19－1)，含水量高，活度级数高，吸附力弱。若“自由水”含量达17％以上，则吸附能力极低。若将硅胶在105～110ºC加热30分钟，则硅胶吸附力增强，这一过程称为“活化”(activation)。如果将硅胶加热至500ºC，由于硅胶结构内的水(结构水)不可逆地失去，使硅醇基结构变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。硅氧桥的生成硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。表191硅胶和氧化铝的含水量与活性关系氧化铝表面的吸附机制：是个尚有争议的问题。有人认为氧化铝表面存在铝羟基AlOH，由于羟基的氢键作用而能吸附其他物质。氧化铝的活性和含水量密切相关。活性的强弱用活度级(I～V)表示，活度1级吸附能力最强，V级最弱。在适当的温度下加热，除去水分可使氧化铝的吸附能力增强(活化)；反之加入一定量水分可使活性降低，称为脱活性(deactivation)3．聚酰胺：由酰胺聚合而成的高分子物质，色谱常用的是聚己内酰胺，其结构如下：商品名为锦纶、尼龙6、卡普隆等。色谱用聚酰胺粉是白色多孔的非晶型粉末，不溶于水和一般有机溶剂，易溶于浓矿酸、酚、甲酸。聚酰胺分子内存在着很多酰胺基，可与酚、酸、硝基化合物、醌类等形成氢键，因而产生吸附作用。由于聚酰胺与这些化合物形成氢键能力不同，吸附能力也就不同，使各种化合物得到分离。一般来说，能形成氢键基团较多的物质，吸附能力较强；邻位基团间能形成分子内氢键者吸附力减弱；芳香核具有较多共轭键时，吸附能力增强。(三)吸附剂和流动相的选择流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的组分分子竞争占据吸附剂表面活性吸附中心的过程。强极性的流动相分子占据极性中心的能力强，而具有强的洗脱作用。非极性的流动相竞争占据吸附活性中心的能力弱，洗脱作用就弱。因此，为了使样品中吸附能力稍有差异的各组分得到分离，就必须根据样品的性质、吸附剂的活性选择适当极性的流动相。1．被测物质的结构、极性与吸附力的关系一般规律①饱和碳氢化合物为非极性化合物，一般不被吸附剂吸附②基本母核相同的化合物，分子中引人的取代基的极性越强，则整个分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强(但要考虑其他因素的影响)③不饱和化合物比饱和化合物的吸附力强，分子中双键数越多，则吸附力越强④分子中取代基的空间排列对吸附性也有影响，例如COHOOHH2CH2CCH2CNCH2CH2OH15V3810IV256III153II50I0氧化铝含水量%活性级硅胶含水量%羟基处于能形成分子内氢键的位置时，其吸附能力降低。常见化合物的极性(吸附能力)有下列顺序：烷烃＜烯烃＜醚＜硝基化合物＜二甲胺＜酯＜酮＜醛＜胺＜酰胺＜醇＜酚＜羧酸。2．流动相的极性与洗脱能力的关系流动相的洗脱能力主要由其极性决定，强极性流动相占据吸附中心的能力强，其洗脱能力强，使组分的K值小，保留时间短。常用溶剂的极性(洗脱能力)的顺序大体是：石油醚＜环己烷＜二硫化碳＜三氯乙烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜正了醇＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜酸。二、离子交换柱色谱法(一)离子交换树脂及其性能以离子交换树脂为固定相的柱色谱法称为离子交换柱色谱法。离子交换树脂是具有网状立体结构的高分子多元酸或多元碱的聚合物。网状结构的骨架一般十分稳定，酸、碱及某些有机溶剂和一般弱氧化剂都不起作用，对热也比较稳定。在其网状结构的骨架上有许多可电离、可被交换的基团，如磺酸基(SO3H)、羧基(COOH)及季胺基(NR3+OH)等，正由于这些基团的存在，才使树脂具有交换能力。常用的聚苯乙烯型离子交换树脂，以苯乙烯和二乙烯苯聚合而成球形网状结构，其中二乙烯苯是交联剂。经浓硫酸磺化后，即制得聚苯乙烯型碳酸基阳离子交换树脂如果用其它基团代替磺酸基，就可以得到一系列阳离子交换树脂。例如COOH、OH等。这些基团上的氢离子可被样品溶液中的阳离子交换阴离子交换树脂具有与阳离子交换树脂同样的有机骨架，只是在骨架上引入了可离解的碱性基团，定相层的板称为薄层板(thinlayerplate)或薄板。按分离机制薄层色谱法可分为吸附、分配和分子排阻色谱法，此外还有胶束薄层色谱法，本节主要讨论吸附薄层色谱法。按分离效能薄层色谱法又可分为经典薄层色谱法和高效薄层色谱法。(一)吸附薄层色谱法如NR3+、NH2、NHR等。这类树脂若离子交换树脂的性能指标1·交联度(degreeofcrosslinking)离子交换树脂中交联剂的含量（重量百分比），即合成树脂时二乙烯苯在原料中所占总重量的百分比。一般树脂含二乙烯苯8％～12％。树脂交联度大，形成网状结构紧密，孔隙小，选择性强。但交联度过大，网眼过小，反而阻碍溶液中离子进入树脂内部，降低离子交换反应的速度，体积较大的离子甚至难于扩散到树脂内部，而降低了交换容量。作一般用途时，选8％交联度的阳离子交换树脂或4％交联度的阴离子交换树脂为宜。2．交换容量(exchangecapacity)每克树脂能参加交换反应的活性基因数。通常以每克干树脂或每毫升溶胀后的树脂能交换离子的毫摩尔数来表示，一般为1～10mmol/g。它反映了离子交换树脂进行交换反应的能力，决定于网状结构内所含有的酸性或碱性基团的CCCCCCCCCCCCCC+CCCCCCCC++...CCCCCCCCCCC++...数目。树脂的结构与组成、溶液的pH等都影响交换容量。3．粒度（granularity)离子交换树脂颗粒的大小，一般以溶胀态所能通过的筛孔来表示。交换纯水用的树脂多通过10～50目筛；分析用的树脂则通过100～200目筛。(二)离子交换色谱法的分离原理以磺酸基(强酸性)阳离子交换树脂为例。溶液中的阳离子，如Na+，与H+发生交换。当树脂上所有可交换的H+均被交换后，树脂失去活性。此时若用稀酸溶液对树脂进行处理，Na+就被高浓度的H+置换(洗脱)下来，树脂的交换能力又被恢复，这一过程称为树脂的再生。交换与再生过程可用下式表示：用离子交换树脂分离不同离子时，样品组分离子与流动相离子在树脂上产生竞争交换，交换能力弱的离子易被流动相洗脱。离子的交换能力可用选择系数表示(见第18章)。选择系数大的离子的交换能力强，保留时间长。结果使离子按选择系数的大小顺序洗脱出柱。离子交换色谱的保留行为和选择性1．离子交换树脂的交联度和交换容量在一定的范围内树脂的交联度越大，交换容量越大，组分的保留时间越长。但交联度不影响价数相同的离子的分离。2．流动相的组成和pH交换能力强的配衡离子组成的流动相有较强的洗脱能力。一价离子的保留与流动相中配衡离子的浓度成反比。强离子交换树脂的交换容量在很宽的范围内不随流动相的pH变化。调节pH的作用主要体现在对弱电解质离解的控制，溶质的离解受到抑制则保留时间变短。弱离子交换树脂的交换容量在某一pH有极大值。3．溶质离子的电荷和水合半径在一般情况下，•价态高的离子选择系数大。•同价阳离子在酸性阳离子交换树脂上选择系数随其水合离子半径的增大而变小。如一价阳离子的水合半径顺序是：Li+＞Na+＞K+＞Rb+＞Cs+；它们的选择系数则是：Cs+＞Rb+＞K+＞Na+＞Li+；同理，二价阳离子的选择系数是：Ba2+＞Sr2+＞Ca2+＞Mg2+。在常温下，稀溶液中阳离子对强酸性阳离子交换树脂的交换顺序是：Fe3+＞Al3+＞Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+Cd2+Cu2+Mn2+Zn2+Mg2+＞K+NH4+＞Na+＞H+。弱酸性阳离子交换树脂的基因(如COOH)较难电离，而且其解离受溶液中H+的抑制，所以H+的交换能力很强，甚至大于二价、三价阳离子。常见阴离子在强碱性阴离子交换树脂上的交换顺序通常为：PO43SO42INO3CN＞NO2Cl＞HCO3OH第三节薄层色谱法一、分类和原理将固定相均匀地涂铺在光洁的玻璃、塑料或金属板表面上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法称为薄层色谱法。铺好固固定相为吸附剂的薄层色谱法。吸附薄层色谱的分离原理：将不同组分的混合溶液点在薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的溶剂(展开剂，developingsolvent，developer)展开。此时各组分不断地被吸附剂所吸附，又被展开剂所溶解而解吸，且随展开剂向前移动。由于吸附剂对各组分具有不同的吸附能力，展开剂也对它们有不同的溶解、解吸能力，即KAKB，因此在展开过程中，各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸，从而产生差速迁移得到