生物化学常用试剂配制

常规试剂配制和测定方法一、溶液的配制1.Mandels营养盐溶液（1000mL）名称重量（g）硫酸铵（(NH4)2SO4）14磷酸二氢钾（KH2PO4）20尿素（H2NCONH2）3硫酸镁（MgSO4·7H2O）3氯化钙（CaCl2·2H2O）4注：用煮沸10min后的蒸馏水配制。2.Mandels微量元素溶液（1000mL）名称重量（g）氯化钴（CoCl2·6H2O）3.7硫酸锌（ZnSO4·7H2O）1.4硫酸锰（MnSO4·H2O）1.6硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）5.0注：用煮沸10min后的蒸馏水配制。3.DNS试剂的配制（1000mL）（1）取：3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）7.5g氢氧化钠（NaOH）14.0g充分溶解于1000mL水中（水预先煮沸10min）（2）加入：酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）216.0g苯酚（在50℃水浴中融化）5.5mL偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）6.0g（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后便可使用，平时盛一小瓶(250mL)使用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。注意：倒入瓶中时要尽量装满！！4.考马斯亮蓝G-250的配制（1000mL）称考马斯亮蓝G-250100mg即0.1g溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250，4.7%（w/v）乙醇，8.5%（w/v）磷酸。5.1.0M柠檬酸缓冲溶液的配制（1000mL）名称分子量Mn重量(g)柠檬酸（C6H8O7·H2O）210210NaOH4074.5准确称取柠檬酸210g，溶于约750mL煮沸（10min）蒸馏水中，待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74.5g，完全溶解后将上述溶液转移到1000mL容量瓶中，冷却后将容量瓶定容到1000mL（原始pH4.45）。（检验方法：取1.0M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍，测定稀释液的pH值，pH值应为4.8）6.标准糖溶液的配制和标准方程的测定（1）标准糖溶液的配制准确称取2.000g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105℃烘干3h），蒸馏水溶解，全部转移至1L容量瓶内，摇匀，配制成2g/L葡萄糖/木糖溶液。取9个100mL容量瓶、1支20mL刻度吸管，分别吸取2g/L葡萄糖/木糖溶液10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L葡萄糖/木糖标准溶液。取6个30mL容量瓶、1支20mL刻度吸管，分别吸取2g/L葡萄糖溶液10mL、12mL、14mL、16mL、18mL、20mL依次加入容量瓶，每瓶再加入1.5mL柠檬酸缓冲液，蒸馏水定容，摇匀。即为1.0g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g酶解葡萄糖。（2）标准方程的测定：①葡萄糖/木糖标准方程的测定取10支25mL刻度管，10支1mL刻度吸管，分别加入0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L葡萄糖/木糖标准溶液1mL，DNS溶液3mL。100℃煮沸5min，水浴冷却后定容至25mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A=MC+N，723型分光光度计输出方程为：C=KA+B）②酶解木糖标准方程测定（测定木聚糖酶活力）取6支25mL刻度管，6支2mL刻度吸管，分别加入1.0g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g酶解木糖标准溶液1.5mL，DNS溶液3mL，100℃煮沸5min，水浴冷却后定容至25mL，摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A=MC+N，723型分光光度计输出方程为：C=KA+B）③酶解葡萄糖标准方程测定（测定滤纸酶活力、CMC酶活力）取6支小试管，6支2mL刻度吸管，分别加入1.0g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g酶解葡萄糖标准溶液1.5mL，DNS溶液3mL，100℃煮沸5min，水浴冷却后，量筒定容至50mL（定容至25mL，测定CMC酶活力），摇匀。以蒸馏水作为空白对照，550nm测定吸光度A。以A为纵坐标，C为横坐标，制定标准曲线。（7230型分光光度计输出方程为：A=MC+N，723型分光光度计输出方程为：C=KA+B）7.柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制pH0.1mol/L柠檬酸/mL0.2mol/L磷酸氢二钠/mLpH0.1mol/L柠檬酸/mL0.2mol/L磷酸氢二钠/mL2.219.600.405.29.2810.722.418.761.245.48.8511.152.617.822.185.68.4011.602.816.833.175.87.9112.093.015.894.116.07.3712.633.215.064.946.26.7813.223.414.305.706.46.1513.853.613.566.446.65.4514.553.812.907.106.84.5515.454.012.297.717.03.5316.474.211.728.287.22.6117.394.411.188.827.41.8318.174.610.659.357.61.2718.734.810.149.867.80.8519.155.09.7010.308.00.5519.45注：Na2HPO4，Mr=141.98；0.2mol/L溶液为28.40g/LNa2HPO4·2H2O，Mr=178.05；0.2mol/L溶液为35.61g/LC6H8O7·H2O，Mr=210.14；0.1mol/L溶液为21.01g/L二、酶活力的测定1.滤纸酶活力的测定—纤维素酶的总体酶活力采用国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的标准方法测定[Ghose,T.K.,etal,Pure&Appl.Chem.,1987,59,257-268]，一个滤纸酶活力的国际单位（FPIU）等于在标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖量的酶量。测定方法如下：取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50mg卷成筒状的滤纸条（1×6cm），适当稀释酶液，取7支试管按下表操作。（5#有底物无酶，6#为有酶无底物空白对照）项目1#2#3#4#5#6#7#稀释酶液（mL）0.20.30.40.500.5酶解葡萄糖标样1.5mL0.05M柠檬酸缓冲液（mL）1.31.21.11.01.51将上述试管盖上塑料布，用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中，保持在振幅80和温度50℃下保温60min后立即取出加入3mLDNS试剂，在沸水中反应5min，冷却后加水至50mL并充分摇匀，待滤纸完全沉淀后，取上层清液于550nm波长下测定吸光度A值。反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标，酶量的对数为纵坐标作图，从图中找出生成2mg葡萄糖的酶量，按下式计算样品的滤纸酶活力（FPA）：滤纸酶活力=2mg葡萄糖60min×0.18(mg/μmol)×生成2mg葡萄糖的酶量（mL）一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，单位：IU/mL。备注：当加入0.5mL酶液（指酶液没有被稀释的时候！）仍无法生成2mg葡萄糖时，按下式计算：滤纸酶活=0.185×（葡萄糖mg数）2.β-葡萄糖苷酶活力的测定方法一：葡萄糖氧化酶测定法按国际标准方法测定[Ghose,T.K.,etal,Pure&Appl.Chem.,1987,59,257-268]。一个β-葡萄糖苷酶活力国际单位(IU/mL)等于标准条件下每分钟转化1μmol底物即生成2μmol葡萄糖的酶量来表示。预先用0.05M的柠檬酸缓冲液配制15mmol/L的纤维二糖溶液（0.513g纤维二糖/100mL0.05M的柠檬酸缓冲液，现配现用）（1）每个样品应做三个不同酶量估计β-葡萄糖苷酶活力（IU/mL）0.10.10.20.3取酶液量（mL）0.5/0.8/1.00.3/0.5/0.80.2/0.3/0.50.1/0.2/0.3（2）加料：试管中加入酶液、缓冲液和纤维二糖溶液如下：酶液量（mL）0.05M柠檬酸缓冲液（mL）纤维二糖溶液（mL）样品适量1－酶液1酶液空白110纤维二糖空白011每个试管共2mL，用塑料纸包扎好。注意：纤维二糖溶液必须用0.05M柠檬酸配制。（3）酶解反应：试管置于50℃水浴中，保温30分钟，取出，沸水中放置5分钟使酶失活，冷却至室温。（4）加显色剂（葡萄糖氧化酶测定试剂）：取试管中冷却液30µL，加入显色剂3.0mL，混匀；同时做一个葡萄糖标样：取1g/L葡萄糖标样30µL，加显色剂3.0mL，混匀；置于37℃水浴中，保温15分钟，取出。（5）测吸光度：505nm，用蒸馏水调零，测各试管溶液吸光度A值。1g/L葡萄糖标样的吸光度为0.7左右。（6）计算产生的葡萄糖mg数：样品吸光度测得酶空白所含葡萄糖=2×（mg）纤维二糖空白1g/L葡萄糖标样吸光度样品实际产生的葡萄糖=[测得葡萄糖mg]－[纤维二糖空白葡萄糖mg]－[酶空白葡萄糖mg]×[酶液量mL]（mg）注：纤维二糖空白所产生的响应值，当纤维二糖溶液为新鲜配制时，一般很低。（7）作图：以log(酶液量mL)为纵坐标，实际产生的葡萄糖mg为横坐标作图，求出生成1mg葡萄糖时对应的酶液量mL。（8）计算β-葡萄糖苷酶活力：0.0926β-葡萄糖苷酶活力=（IU/mL）生成1mg葡萄糖对应的酶液量（mL）注：当加入1mL酶液仍不能生成1mg葡萄糖时，β-葡萄糖苷酶活力=0.0926×（葡萄糖mg数）☆补充：葡萄糖含量测定采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法测定。葡萄糖测定试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司生产，内含R1（缓冲液）和R2（酶试剂），使用时将R1和R2等量混合。葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将4-氨基安替比林与苯酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。测定该有机化合物的吸光度便能计算出葡萄糖的含量。测定方法如下：在测定管中加入30µL待测试样的稀释液（空白管、标准管分别以蒸馏水及1g/L的葡萄糖标准溶液代替），每一试管中加入由R1和R2等量混合的酶酚混合液3.0mL，将各试管分别摇匀，置于37℃水浴中保温15min，冷却至室温后，在7230分光光度计上于505nm下测定吸光度A值，用空白管校正吸光度到零点，葡萄糖含量按下式计算：葡萄糖含量（g/L）=×稀释倍数方法二：采用pNPG（对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷）试剂测定（1）试剂的配制①50mmol/L,pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制（200mL）方法：0.1mol/L柠檬酸101.4mL+0.2mol/L磷酸氢二钠98.6mL②1mol/LNa2CO3溶液（250mL）称取：26.5gNa2CO3溶解后定容至250mL③5mmol/LpNPG（分子量：301.25）溶液的配制（100mL）称取0.1506gpNPG，用50mmol/L，pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后定容至100mL。（2）对硝基苯酚标准方程的测定①对硝基苯酚标准溶液的配制准确称取0.0209g对硝基苯酚（分子量：139.11），蒸馏水溶解，全部转移至100mL容量瓶内，摇匀，配制成1.5mmol/L对硝基苯酚溶液。取6个30mL容量瓶，分别吸取1.5mmol/L对硝基苯酚溶液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.05mmol/L、0.1