石油污染海水中细菌群落的动态变化1

第22卷第4期宁波大学学报(理工版)、，01．22No．42009年12月JOURNALOFNINGBOUNIVERSITY(NSEE)Dec．2009文章编号：1001—5132(2009)04—0477—07石油污染海水中细菌群落的动态变化0博，沈璐，张德民(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波315211)摘要：利用PCR．DGGE和构建16SrDNA克隆文库等技术比较分析了石油污染海水中石油降解菌的数量、茵群组成以及石油降解率的动态变化．实验结果表明：在宁波港口海域天然海水外源石油降解的21d过程中，海水中原有的石油降解菌数量很少，但污染石油后，其数量快速增加，在第14d达到最大值，为2．40x10cels．mL～，该时期所含菌体种类也最多．石油降解过程中主要细菌类群不断发生演替，第7d时Alcanivorax与Thalassospira取代水样中原有细菌成为优势茵，第14d时的优势菌中又增加了Pseudomonas，第21d时前两时期的主要细菌减少，Acinetobacter和Parvibaculum等属的细菌成为这一时期的优势菌．14d后，石油降解率最高，达17lfmg·d)·L～，21d后石油降解率为28．74％．．关键词：变性梯度凝胶电泳(DGGE)；石油降解菌：菌群动态变化中图分类号：Q938．1文献标识码：A近年来，海上溢油事故频繁发生．据统计，1970～2007年问全世界发生超过7t以上的溢油事故共汁1744起，在这些事故中共有5648000t石油泄漏到海洋中．研究表明，泄漏的石油会长时间存在于海洋自然环境中，对远洋和沿海地区的生态环境造成极大的危害[2】．溢出石油进入海洋后，将经历溶解、挥发、光氧化分解以及生物降解等一系列过程『3】，其中生物降解是彻底消除污染石油的最重要途径．微生物，尤其是细菌，在石油的生物降解过程中起着重要的作用．目前，许多研究人员已从海洋环境中分离得到了多种石油降解细菌，这些细菌主要包括，cfvD愀[4‘、Cvcloc，aticus[6J、ThlasDlituus[71、Oleispira[引Oleiphilu、Neptunomonas[们、、MarinD6】AcinetobacterISphingomonas[0、、Planococcus[j和6【l5I等．溢出石油会使污染海域的微生物菌群结构发生变化Il，如能对石油降解微生物群落的动态变化进行监测分析，将对分离高效降解菌，发展石油污染处理技术具有重要的指导意义．不依赖于培养的分子生物学技术为研究石油降解菌群落结构及其演替提供了强有力的工具，变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术就是其中之一．自从Muyzer等人【】7J在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究之后，DGGE技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落收稿日期：2008-12-29．宁波大学学报(理工版)网址：htp：／3xb．nbu．edu．ca基金项目：．科技部科技基础条件平台建设项目(2005DKA2120609)；宁波大学学科项目(XK200542)；浙江省新苗人才计划项目(2007R40G2070029)．第一作者：李博(1980一)，男，吉林长春人，在渎硕士研究生，主要研究方向：海洋环境微生物．E-mail：[e-mail]通讯作者：张德民(1964一)，男，河南范县人，教授，主要研究方向：资源与环境微生物．E-mail：[e-mail]-cn478宁波大学学报(理工版)结构的主要分子生物学方法[18-19】．作者通过现场调查、采集样品和实验模拟，利用PCR．DGGE技术对宁波港海域土著石油降解菌在降解石油过程中菌群的动态变化进行监测分析，了解港VI受污染海域的自身修复能力，初步探索出一套简单高效的石油降解菌菌群动态变化和降解能力的分析检测方法，为宁波港海域的石油污染治理提供科学依据和决策参考．1材料与方法1．1实验材料1．1．1培养基Zobel2216E培养基：蛋白胨5g、磷酸高铁0．01g、酵母膏1g、琼脂15g、陈海水l000mL，pH7．6～7．8．改进的Bushnel1．HaasBroth[。：硫酸镁0．2g、氯化钙0．02g、磷酸二氢钾lg、磷酸氢二铵1g、硝酸钾1g、氯化铁0．05g、氯化钠33g、纯水1000mL，pH7．0．1．1．2仪器设备变性梯度胶电泳仪(Dcode，BIO．RAD)，DNA扩增仪(PTC一200，BIO—RAD)，离心机(Centrifuge5415，Eppendorf)，恒温摇床，紫外分光光度计(UV一3100，Mapada)．1．2实验方法1．2．1样品的采集及处理2008年5月27日在象山港上阳渡口采集5L表层水样，用无菌采样瓶装好，4℃保存，立即带回实验室处理．现场测定水温19℃，气温25℃．水样pH值7．91，比重1．020，计算出盐度为30．6．将采集水样分成2部分，一部分水样用0．22pm无菌微孔滤膜收集细菌菌体，然后将滤膜浸泡于STE缓冲液中，一20℃保存，直到进行DNA的提取．另一部分水样分装于250mL锥形瓶中，每瓶装100mL，立即用于石油降解实验．用2216E培养平板对水样中的异养细菌进行计数，同时用改进的Bushnel1．HaasBroth培养基(每升培养基中加入l％(v)已除菌的0柴油)对石油降解菌进行MPN法计数”．采用紫外分光光度法测定海水样品中的初始含油率．1．2．2石油降解实验及细菌数量的测定将市售0柴油用0．22m无菌微孔滤膜过滤除菌，按1％(v)的比例分别接入已经分装好的各100mL水样中，向每瓶中添加硝酸铵和磷酸二氢钾作为无机营养盐，使其浓度分别为20mg·L。和10mg·L。【2引．同时，将部分海水样品121。C高温灭菌后再以每瓶接入1％(v／v)除菌柴油作为空白对照，将所有样品放入恒温摇床中，3O。C，120rpm培养．分别在第7d、第14d、第21d测定样品中可培养异养细菌和石油降解菌的数量．1．2-3石油降解率的测定在石油降解的第7d、第14d、第21d用重量法【24定样品中的残油量，与空白对照相比较，计算石油降解率．微生物培养液对柴油的降解率公式为：7=(1-c(1-／)×l00．(1)微生物培养液对柴油的降解速率公式为：=c0q／(ATV)，(2)式中：'7为柴油降解率(％)，C，为剩余柴油含量(mg·L)，Co为初始柴油含量(mg·L)，为柴油降解速率((mg·d)·LJ)，△为取样时间间隔(d)，V为培养液体积(L)．1．2．4DNA提取及16SrDNA的PCR—DGGE分析分别在石油降解的第7d、第14d、第21d离心收集菌体，用STE缓冲液重悬浮，一2O。c保存，直到DNA的提取．采用SDS沸水浴+酚氯仿抽提法【251提取石油降解实验中所收集菌体的DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA产量．采用细菌16SrDNA的通用性引物341f+GC(5’一CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTACGGGAGGCAGCAG一3’1和518r(5’．ATT第4期李博，等：石油污染海水中细菌群落的动态变化479ACCGCGGCTGCTGG．3’)对提取的DNA扩增，其扩增产物长度约为230bp，用于后续的DGGE分析．PCR采用Touchdown程序．最初的退火温度设置为65℃，然后每个循环减少1℃，直到最终的退火温度为55℃，再进行20个循环．使用变性凝胶电泳仪对PCR产物进行DGGE分析．梯度胶变性浓度为40％～70％，点样量为每孔8，l80V，55℃，电泳6h．凝胶用银染法进行染色，并对结果拍照．1．2．5l6SrDNA克隆文库的构建与测序将天然海水样品以及石油降解实验中第7d、第14d、第2ld样品所提取的DNA用细菌通用性引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG一3’)和l541r(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT．3’)扩增细菌16SrDNA的部分序列，然后与PMDI8-T载体连接，分别转化到大肠杆菌感受态细胞中，构建出4个时期细菌菌群的16SrDNA克隆文库．分别在每个文库中随机挑选60株阳性克隆子进行扩繁提取质粒，进行PCR．DGGE分析筛选．然后将与石油降解过程中菌群DGGE图谱上相对应的代表性克隆子送上海生工进行测序．2结果与分析2．1石油污染海水中细菌数量的变化细菌计数的实验结果如图1所示．所采集天然海水中可培养异养细菌的数量为4．1×10cfu．mL～而石油降解菌的数量仅为9cels·m，比前者低近3个数量级．在降解过程中，可培养异养细菌的数量先是呈增长趋势，在第7d时达到最大值，然后逐渐减少．石油降解菌的数量也是先增加再减少，其值在第14d达到最大．到后期，几乎所有的可培养细菌都是石油降解菌．2．2外源石油在自然海水中的降解所采集天然海水样品中石油类含量为0．0467mg‘L～．加入l％(v／v)0柴油进行降解，21d后所测—g8∞旦氇蚤时ful／d图1石油降解中可培养异养细菌和石油降解菌的数量得降解量和降解率结果见表1．在历时3周的石油降解实验中，降解量和降解速率都随时间的增加而递增，第2周较第1周有小幅提升，而第3周较02周的增幅突然加大，其降解量超过前2周之和．0l海水中不同时段石油降解量、降解率与降解速率2-3石油降解过程中细菌群落结构的动态变化PCR．DGGE对海水细菌群落的研究(图2)显示，降解第0d的泳道中有A、B2条主带，其他条带清晰度不明显，说明A、B2带所代表的细菌很可能是原始水样中的优势菌，应该不是石油降解菌．而在石油降解第7d的样品泳道上，与A带和B带相对应的位置上均没有条带，而新出现C、D、E3条主要条带，表明石油降解7d以后，C、D、E带所代表的细菌取代细菌A、B成为了菌群中的优势菌，菌群的结构改变较明显．0，7，14，21表示石油降解第0d、第7d、第14d、第21d的样品图2石油降解中海水细菌群落16SrDNA的DGGE图谱降解第14d的泳道中，有3条主要条带与第7d的c、D、E相同，说明这3种菌在菌群里仍然480宁波大学学报(理工版)2009存在．此外，还出现了F、G为代表的几条新的条性来看，天然海水与石油降解3个时期的菌群差异带．在4个泳道中，这一时期的主要条带数量最多，都比较明显，石油降解第7d与第14d的相似性较说明可能其降解菌多样性比第7d和第21d时丰富．高，但主要条带数量却没有第14d的多，第14d和在石油降解第2ld、第7d和第14d出现的主第21d的相似性很小．要条带都减弱甚至消失，取而代之的是H、I、J等2．4代表性克隆菌株测序几条主要条带，这几条条带在前3个时期的样品中实验中筛选出的克隆子的测序比对结果见表都不明显，说明降解第2ld的菌群中的优势菌已2．绝大多数与DGGE主要条带相对应克隆子的数3一b6经完成从C、D、E条带代表的细菌向H、I、J代量在各自克隆文库中所占的比例较高，基本为各表的细菌的演替．自时期的优势菌，其中，Alcanivorax，Thalassospira，根据这4个时期主要条带数目和清晰度大体Pseudomonas，Acinetobacter以及Parvibaculum等可以判断，天然海水水样被石油污染后，水体中的属的细菌很可能在石油降解过程中起重要的作用．主要菌群发生了明显的演替．就菌群结构的相似此外，第21d的I带所代表的细菌与数据库中表2与DGGE图谱(图2)中主要条带相对应的克隆子测序比对结果克隆文库／d优势克隆克隆数百分IrL／％DGGE条带相似序列同源性UnculturedcyanobacteriumclonePI4a8g0第一l728．3A(AY580397)98Unculturedalphaproteobacterium第二l423-3BNAC1—3(AF2456161l00第三第四7第一2643．3EThalassospiraepidiphila(AB2658