细菌胞外多聚物EPS在工程上应用现状及研究进展

细菌胞外多聚物(EPS)在工程上应用现状及研究进展摘要：本文概述了细菌胞外聚合物的特性、提取方法，综述了国内外近年来有关细菌胞外聚合物及其主要成分在矿物加工、环境、食品、生物医学等工程上应用的现状和研究进展。关键字：胞外聚合物；特性；提取方法；工程；应用中图分类号：文献标识码：A文章编号：细菌胞外聚合物(extracellularpolymericsubstancesEPS)是指附着在细菌表面或围绕在细菌周围，水道、孔隙穿通其间，形成蘑菇状膜结构，用于自我保护和相互粘附的天然有机物[1-3]。EPS在细菌微生物群体中广泛存在，在细菌的粘附聚集、空间构型、细菌间信息交流、耐药性、抗毒性及细菌与外界物质的吸附、沉降、絮凝、脱水等各方面都起着重要作用。由于EPS其独特的性质，引起了越来越多的研究者的重视，并且很多研究成果在工程上得到了广泛的应用，如在矿物加工工业利用EPS作抑制剂浮选硫化矿、在环境工程中利用其处理废水和污泥等、在食品工业上用作食品添加剂和保鲜剂等、在生物医学上被用于疾病预防和保健等[3-11]。本文着重介绍了EPS的特性、提取方法，综述了近年来EPS和其主要成分在不同工程领域中的研究和应用现状。1胞外聚合物的特性1.1胞外聚合物的组成及形态EPS主要来源于细菌的分泌、细菌表面物质的脱落、细菌溶解以及对周围环境物质的吸附。EPS是由荚膜、粘液层及其他表面物质组成，其有机部分包括多糖、蛋白质、核酸、磷脂、褐藻酸、腐质酸等，主要是多糖和蛋白质；其无机部分约占总量的10%-20%[2]。胞外聚合物(EPS)可分为紧密粘附EPS(TightlyBoundEPS，TB)和松散附着EPS(LooselyBoundEPS，LB)，TB位于内层，与细胞表面结合较紧，稳定的附着于细胞壁外，具有一定外形；LB位于TB外层，具有比较松散的结构，是可向周围环境扩展、无明显边缘的粘液层[12]。目前国内外对胞外聚合物结构的研究主要采用激光共聚焦显微镜(CLSM)与不同荧光探针合用、多光子共聚焦镜、原子力显微镜和傅里叶变换红外光谱仪、电镜等先进的仪器进行分析。Neu等[13]比较了传统单量子CLSM和双光子CLSM(2P-LSM)的差别，证实了EPS结构呈现空间和时间的多样性。原子力显微镜和傅里叶变换红外光谱仪可以完整地观察到EPS呈高度含水的聚合凝胶状结构。镧固定处理黄色粘球菌后用透射电镜观察发现，EPS围绕在细菌周围并呈高电子密度的纤维网格状结构[14]。电镜对非磷酸合成异养菌的观察，证实生物膜中EPS是各种微生物产生的空间结构多样化的基质，并且相互间有明显的分隔界限[15]。顾笑梅等[16]证实Enterococcusdurans产胞外多糖EPS-I五糖重复单元结构。基金项目：国家自然科学基金资助项目（50674029）；国家高技术研究发展计划项目（2006AA06Z127）；高等学校博士学科点专向科研基金（20060145015）；辽宁省自然科学基金资助项目（20052030）作者简介：朱长亮（1980-），男。硕士。通讯作者：杨洪英(1960-)，女，博士，东北大学教授、博士生导师；E-mail:[e-mail]。贾炳国（1955-），男，高级工程师，河北邯邢矿冶设计院有限公司院长兼总经理。徐春菊(1965-),女，高级工程师，河北邯邢矿冶设计院有限公司副院长1.2胞外聚合物的物化性质细菌胞外聚合物表现出的一些物化性质是它被广泛应用的原因，这些物化性质有：(1)表面负电荷性：EPS中含有多种有机官能团，如羟基、羧基和其他官能团，这些官能团在溶液中呈负电荷性。(2)吸附性：组成EPS的都是一些大分子物质，具有很大的表面积，加上表面的各种极性和非极性基团，具有吸附的能力。(3)絮凝性：组成EPS的官能团分子量较大，一个分子可以同时与几个悬浮颗粒通过离子键、氢键的作用相结合，在适宜条件下，迅速形成网状结构而沉积，从而表现出絮凝能力[17]。(4)亲水疏水性：蛋白质、腐殖酸、尿酸是EPS中的疏水性部分，而糖类则是亲水性的主要成分[18]。此外胞外聚合物对附着的生物膜具有很多功能，例如移动性、保护和维持作用[19]。2胞外聚合物的提取方法经过近二十年的研究工作者的探索与尝试，人们已经研究出多种不同的胞外聚合物提取方法。这些方法大致可以归结为物理提取法和化学提取法。物理提取法主要是利用各种外力来增强胞外聚合物中各成分在溶液中的溶解度，其中常用的包括超声波法、超声离心法、热处理提取法、蒸汽热提取法等，但是由于EPS和细胞壁结合很紧密，物理提取法的提取效率很低[19-27]；化学提取法的过程：首先是试剂的离子或分子从溶液中进入生物膜与胞外聚合物相接触，即生物膜的内传质过程，然后是EPS的大分子在试剂离子或分子的作用下成为水溶性成分而被提取出来，其中常用的包括NaOH提取法、H2SO4提取法、EDTA提取法、阳离子交换树脂法、戊二醛提取法等，化学提取法可以提高产率，却造成较多细胞死亡，使胞内物质外流并污染样品[27-34]。表1给出了常用的生物膜胞外聚合物提取方法并粗略简述了不同方法的操作（见表1）。表1生物膜胞外聚合物提取方法Table1Extractmethodofextracellularpolymericsubstancesfrombacteria类别方法简述操作说明文献物理法超声波法样品放入超声波清洗器处理后，离心,取上清液.提取效率低19-21,25,27蒸气热提取法样品置于高压灭菌釜中处理后，离心,取上清液.细胞死亡率低22,25热提取法生物膜样品置于水浴中处理后,离心,取上清液.提取效率高，细胞破坏严重23-25,27常规离心生物膜样品置于高速离心机中离心，取上清液.温和，提取效率低26,27化学法NaOH提取法样品离心后弃上清液,加入NaOH于沉积物中,轻轻搅动,然后用水稀释,离心,取上清液.细胞破坏严重25,28EDTA提取法将EDTA加入样品中,放置,离心,取上清液.提取效率高，但存在仪器的干扰25,27-29硫酸提取法样品中加入一定量硫酸后,震荡,离心,取上清液.提取效率高，细胞死亡率低6,27,28阳离子交换树脂法在生物膜样品中先加入一定量的提取缓冲液,然后再加入Dowex离子交换树脂搅拌,离心,取上清液.温和，提取效率高，细胞死亡率小6,25,31,32甲醛-氢氧化钠法生物膜样品中加入甲醛和氢氧化钠溶液处理,离心,取上清液.提取效率高，但会对分析产生影响6,27,33甲醛-超声波法生物膜样品中加入甲醛，放入超声波清洗机中处理,离心,取上清液.提取量小，对细胞伤害小33戊二醛提取法根据生物膜样品菌种的不同，加入适量的戊二醛溶液,搅拌,离心,取上清液.提取效率高，细胞死亡率小，但影响对糖类的测定6,25,343胞外聚合物在工程上的研究和应用3.1胞外聚合物在矿物加工工程中的研究和应用随着生物技术在矿物加工工程上的广泛应用，生物胞外聚合物在矿物加工工程中的作用的研究得到了研究者的重视。V·沃克德等[4]采用细菌胞外聚合物作抑制剂来浮选硫化矿，其基本思路是利用细菌胞外聚合物替代矿物浮选中的金属盐类和氰化物作为抑制剂，这样可以显著的降低金属盐类和氰化物的消耗，不仅可以获得较好的经济效益，而且还解决了使用金属盐类和氰化物带来的环境污染问题。作者从汉堡大学菌株收集中心得到的20种嗜酸的氧化亚铁硫杆菌菌株中的4株分离出EPS，分别采用纯矿物和矿物混合物进行浮选试验，结果表明提取的EPS对所研究的全部硫化物(黄铁矿、黄铜矿、方铅矿和闪锌矿)具有抑制作用。卡伍德等[35]利用羧甲基纤维素研究多聚物是否能从滑石表面上被解吸，这个研究的背景是多聚物被利用在浮选天然可浮性矿物条件下。在矿物加工工程上很多研究者借鉴环境领域有关细菌胞外聚合物在处理重金属废水的研究，应用胞外聚合物在矿物浮选过程中作生物絮凝剂。索马桑达兰等[36]研究指出，细菌及胞外聚合物可增强方解石的絮凝。应用细菌胞外聚合物在有色金属的湿法浸出及从有色金属废渣中回收重金属的研究，国外起步较早，1998年GEHRKE等[37]研究指出，吸附至矿物表面的细菌被自身产生的EPS所包裹，而EPS又介导了细菌与硫化矿物能源的接触，在生物膜的形成和细菌—基质的界面作用中起着重要作用。国内近几年随着生物技术的应用，胞外聚合物在湿法冶金领域中的应用研究成为热点。傅建华等[38]首次采用了电镜细胞化学方法证实了T.f菌胞外多聚物的存在，T.f表面存在脂类、多糖和蛋白质等物质，由它们所形成的胞外多聚物(EPS)是细菌的真正功能表面。EPS在细菌与矿物之间的复杂界面作用中起着极其重要的作用。笔者认为胞外聚合物随着矿物加工行业的不断发展，胞外聚合物在矿物加工工程中的作用会越来越大，主要会体现在：1)与其他处理方法结合处理低品位难处理矿石；2)作为矿物浮选的生物药剂代替昂贵的对环境有危害的化学药剂，例如浮选时使用的抑制剂、絮凝剂；3)与其他方法结合处理固体废弃物，回收有价金属；4)除去矿物产品中的杂质，例如除去煤中的硫、除去钢渣和锰矿石中的磷。3.2胞外聚合物在环境工程中的研究和应用近年来在环境工程中有关EPS的研究和应用已经成为热点，与EPS在其他方面应用的研究相比较其理论性研究较深入，应用也较广泛。胞外聚合物在环境工程中的应用主要是去除废水中重金属。随着全世界金属消耗量呈上升趋势，这意味着金属废物也在增加。这类含有多种重金属离子的废物一旦被排到自然环境中，将严重危及人类和许多动、植物的正常生存。由于胞外聚合物可以和金属离子之间相互作用[39]，即在带负电性的胞外聚合物中金属离子可以起到架桥的作用。在废水处理工程中，利用胞外聚合物的这一特点去除废水中的金属离子。对于胞外聚合物去除废水中金属离子的机理，研究者提出了不同的观点，简要可以归纳为：(1)首先沉淀的金属离子被生物膜絮凝物捕获[40-42]；(2)胞外聚合物与可溶性金属成键[19]；(3)细胞对可溶性金属的积累[43,44]；(4)金属向大气中挥发[45,46]。吉林大学张道勇等[47]研究了细菌生物膜所分泌的胞外聚合物(EPS)与藻菌生物膜去除毒性金属Cd之间的关系。结果表明，EPS主要由丝藻产生，其含量与污水中Cd的去除效率及生物膜中Cd的积累量之间相关性良好。董德明等[48]研究了长春南湖水中优势菌种的胞外聚合物对Pb、Cd、Mn吸附的规律，指出3种金属在胞外聚合物上的吸附均遵守Langmuir和Freundlich热力学方程，并指出Mn的存在会影响EPS对Pb、Cd的吸附。康春莉等[49]研究细菌胞外聚合中多糖对Pb、Cd的吸附得到了相同的结论，同时指出Cd干扰胞外多糖对Pb的吸附，Pb干扰胞外多糖对Cd的吸附。苏春彦等[50]通过红外光谱分析研究了胞外有机组分吸附Pb2+的机理。潘响亮等[51,52]研究了硫酸盐还原菌混合菌群胞外聚合物对Cu、Zn的吸附和机理，结果表明，硫酸盐还原菌(SRB)混合菌群分泌的EPS能有效的吸附水溶液中的Cu2+、Zn2+,Langmuir等温方程和Freundlich等温方程能拟合EPS吸附Cu2+实验所得吸附数据,而对Zn2+能用Freundlich等温方程拟合。SRB混合菌群分泌的EPS的FT-IR分析表明，EPS对Cu2+的吸附主要在于EPS中的蛋白质的酰胺(Ⅱ)、羧基、多聚糖的C-O-C、-OH和脂类等基团对Cu2+的强络合能力；吸附Zn2+起主要作用的官能团是多聚糖C-O-C，羧基和脂类官能团，而蛋白质和多聚糖的-OH对Zn2+的结合能力有限。吕英等[53]以胞外聚合物作为生物吸附剂，对水中微量Cu2+的生物吸附特性进行研究，指出Cu2+的吸附过程可分为3个阶段：①8min的快速吸附阶段；②8-40min到达表观一级动力学吸附阶段；③吸附-解吸平衡阶段。Cu2+吸附等温线与Freundlich方程拟合良好。王竞等[54]研究了新型细胞外聚合物对水中重金属Cr(Ⅵ)的吸附特性，结果表明，EPS对Cr(Ⅵ)的吸附的最佳pH为0.5-2.0，Cr(Ⅵ)的吸附可分为三个阶