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一株吡嘧磺隆降解菌S8-1的分离鉴定及生物学特性摘要:以多年连续施用吡嘧磺隆除草剂的水稻试验田泥土为材料,采用富集培养、平板反复划线分离方法,分离到一株能以吡嘧磺隆为唯一碳源和能源生长的光合细菌(PhotosyntheticBacte-rium,简称PSB),命名为S8-1。通过菌落形态特征观察、菌体形态学观察、活细胞吸收光谱特征、培养特性、生理生化特性及16SrRNA同源性序列分析(GenBank登录号:GQ180069)等试验,初步鉴定该菌为红假单胞菌属(Rhodopseudomonassp.)。利用高效液相色谱(HPLC)测定了菌株S8-1的降解性能,得出该菌降解吡嘧磺隆的最佳条件为:pH值为7.0−7.5,温度为30°C−35°C;在30°C与pH7.0的光合细菌培养基中培养7d,对100mg/L的吡嘧磺隆降解率为52.07%;并且该菌对浓度高达800mg/L的吡嘧磺隆仍保持降解活性,外加发酵提取物能够明显提高菌体的生长及其降解效率,显示了该菌在高浓度农药废水处理及土壤农药残留生物修复方面潜在的开发价值。关键词:吡嘧磺隆,富集培养,光合细菌,红假单胞菌属Isolation,IdentificationandBiologicalCharacteristicsofaPyrazosulfuron-ethylDegradingBacteriumStrainS8-1Abstract:Astrainofphotosyntheticbacteriumcapableofdegradingtheherbicidepyrazosulfu-ron-ethyl,designatedasS8-1,wasisolatedandpurifiedfromthericeexperimentalfieldsoilsampleswhichhavebeensuccessivelyusedpyrazosulfuron-ethylformanyyearsbycontinuousenrichmentculturetech-niques.Theisolateexhibitedsubstantialgrowthinmineralsaltmediumamendedwithpyrazosulfu-ron-ethylasasolesourceofcarbonandenergy.Basedonthecolonyandcellmorphologicalobservation,absorptionspectraoflivingcells,culturalandbiochemicalcharacteristics,andthesequenceanalysisofthepartial16SrRNAgene,theisolateS8-1hadbeenpreliminaryidentifiedasRhodopseudomonassp..Highperformanceliquidchromatography(HPLC)dataanalysisrevealedtheoptimumdegradationcondi-tionsofstrainS8-1were:pHvalueat7.0−7.5andtemperatureat30°C−35°C,respectively.Atthecon-尹乐斌等:一株吡嘧磺隆降解菌S8-1的分离鉴定及生物学特性1433°Cand7500lxoflightilluminationintensity.ThestrainS8-1stillmaintaineddegradationactivityattheconcen-trationofpyrazosulfuron-ethylupto800mg/L,additionalyeastextractcansignificantlyincreasethegrowthspeedanddegradationrate.TheresultindicatedthatstrainS8-1haspotentialvalueforbiodegrada-tionofpyrazosulfuron-ethylplantwastewaterorcontaminatedsoilsandwaters.Keywords:Pyrazosulfuron-ethyl,Enrichmentculturetechnique,Photosyntheticbacterium,Rhodop-seudomonassp.磺酰脲类除草剂是目前世界上最大的一类除草剂,其除草机理为抑制乙酰乳酸合成酶(ALS),阻碍细胞分裂而达到杀草目的[1]。随着该类除草剂使用量及范围的加大,其在作物中的残留以及对人类健康和环境造成的毒害也越来越为人们所关注[2]。吡嘧磺隆(Pyrazosulfuron-ethyl)属磺酰脲类高活性内吸选择性除草剂,药剂主要通过植物的根系被吸收并在植物体内迅速进行传导,用于防治水稻田一年生和多年生阔叶杂草和莎草科杂草,以提高作物产量。近年来随着吡嘧磺隆在水稻直播田的广泛应用,药害问题也在不断发生,不同品种水稻的耐药性有差异,早稻品种对其安全性好,晚稻品种(粳、糯稻)对其相对敏感[3]。因此,研究解决吡嘧磺隆残留毒害问题对扩大该药剂在稻田生产中的应用,减少对后茬作物及环境造成的污染具有重要的理论和实践意义。研究表明,微生物降解是除草剂从土壤中消失的重要因素,目前分离得到能够降解磺酰脲类的微生物主要有浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus)[4−6]、青霉菌属(Penicilliumsp.)[4,7]、放线菌属(Actinomycetes)[8]、黄单胞菌属(Xanthomonassp.)[9]、睾丸酮丛毛假单胞菌(Comamonassp.)[10]、假单胞菌(Pseudomonas)和芽孢杆菌(Bacillus)[11−14]等。然而,关于光合细菌降解吡嘧磺隆还未见报道,笔者从多年施用吡嘧磺隆的水稻直播试验田分离筛选出能够降解吡嘧磺隆的光合细菌,并对吡嘧磺隆的降解特性进行了初步研究,不仅丰富了微生物降解菌资源,还可为生产上利用该菌株对吡嘧磺隆除草剂污染土壤的原位生物修复提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1土壤样品及供试农药:采自长期施用吡嘧磺隆除草剂的湖南省植物保护研究所水稻直播试验田的土壤样品。100mg/L吡嘧磺隆标样储备液(农业部环境保护科研监测所研制,天津市)。97%吡嘧磺隆原药(江苏常隆化工有限公司)。吡嘧磺隆残留检测由湖南省植物保护研究所农药残留检测室完成检测。1.1.2供试培养基:PSB液体富集培养基的配制具体参照文献[15]的方法;PSB分离纯化培养基为在RCVBN培养基[16]中分别加入1.3%和1.8%的琼脂;唯一碳氮源培养基为MSM培养基。生理生化试验所用培养基配方参照文献[17−18]。除特别说明外,所有的培养基pH值为7.0左右,1×105Pa灭菌30min。1.2试验方法1.2.1菌株S8-1的富集、驯化培养:取适量的土壤样品置于120mL的PSB液体富集培养基的培养瓶中,加入吡嘧磺隆使其终浓度为100mg/L,在温度为30°C、光照强度为7500lx的智能人工气候箱中富集培养1−2周,光照培养期间每天手动摇匀3−5次,可以观察到光合细菌在瓶壁上聚集,培养基也变成红棕色。然后取2mL培养液转接至新鲜的富集培养基中,加入吡嘧磺隆使其终浓度为200mg/L,同等条件下培养至培养液变棕红。依照前面的方法连续富集、驯化培养10代,吡嘧磺隆的浓度也渐渐提高到1000mg/L。1.2.2菌株S8-1分离及纯化:参照孙军德等[19]的方法并稍加改进,利用双层平板夹心法对富集、驯化的菌体培养液进行分离纯化。在直径为9.5cm的培养皿中加入含200mg/L吡嘧磺隆的1.3%PSB分离培养基,待其凝固后富集菌液用接种环划线,待水汽稍干后再加入含同样浓度农药的1.8%PSB分离培养基,用封口膜封好培养皿,置于上述同等条件的光照培养箱中培养1周左右,用灭菌的牙签挑取双层平板夹心层的单菌落于PSB液体培养基中光照扩大培养,用同样的方法反复分离纯化3−5次,直1434微生物学通报2010,Vol.37,No.10至获得纯培养物并保存,单菌落培养物编号为S8-1。1.2.3菌株S8-1的鉴定:(1)传统的细菌菌落形态、菌体形态及生理生化鉴定:以双层平板夹心层上生长的菌落形态描述菌落颜色、大小和形状。菌体形态用光学显微镜(BX51,OLYPUS)与电子显微镜(JEXL−230,日本电子公司)观察相结合。革兰氏染色方法参照文献[20]。菌体的其它形态特征、培养特性及生理生化试验参照文献[17−18,21]选择相应试验,并结合《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)[22]进行菌种鉴定。(2)菌株S8-1活细胞吸收光谱的测定:取2mL培养6d的菌液纯培养物在8000r/min离心10min收集菌体沉淀,用灭菌的生理盐水洗涤菌体沉淀3次,沉淀最后悬浮于60%的蔗糖溶液至原体积,以60%的蔗糖溶液做参比,用北京普析Tu-901型双光束紫外可见分光光度计检测菌体的活细胞吸收光谱,扫描波长范围为300nm−900nm。(3)菌株S8-1的16SrRNA序列测定:菌体基因组DNA的提取采用上海生工生物工程技术服务有限公司的UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒,具体方法参照说明书。以所提取的细菌总DNA为模板,在Eppendorf公司MastercyclergradientPCR仪上进行16SrRNA序列扩增,所用引物为原核生物16SrRNA通用引物(8F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[23],引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系(50μL):10×PCRBuffer(Mg2+plus)5μL,dNTPs(各2.5mmol/L)4μL,8F/1492R引物各1μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL,ddH2O37.75μL,模板DNA1μL。PCR反应程序为:94°C5min;94°C1min,50°C1min,72°C1min,34个循环;72°C10min。用BioDevGelExtractionSystemB试剂盒进行胶回收,回收纯化后的产物送上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序。(4)菌株S8-116SrRNA序列同源性比对及系统发育树构建:将获得的16SrRNA序列的测序结果在NCBI中进行BLAST同源性比对检索,选出序列相似性大于96%的部分登录号,应用MEGA4.0软件构建系统发育树。1.2.4菌株S8-1的最适生长条件研究:不同培养条件对菌株S8-1生长的影响,主要的影响因素包括不同的温度、pH值、光照强度及吡嘧磺隆浓度。1.2.5菌株S8-1的降解能力检测:(1)样品的前处理:样品的前处理参照文献[24−26],并稍加改进。将菌液充分摇匀,取1mL菌液,用流动相定容到10mL,超声波萃取处理20min,通过C18柱固相萃取柱净化后,以3种不同比例的丙酮和正己烷混合剂分3步洗脱,氮气吹干,5mL乙腈溶解,过0.22μm有机滤膜,供HPLC测定。(2)高效液相色谱条件:流动相(经过优化后的配比):乙腈/水(用磷酸调节pH值3.0)=70:30(V/V);流速:1mL/min;柱温:30°C;进样量:10μL;检测波长为241nm。(3)菌株S8-1对吡嘧磺隆降解率的测定:吡嘧磺隆降解率的计算公式为:吡嘧磺隆降解率(%)=(CK−CS)/CK×100%。其中CS降解菌处理后的吡嘧磺隆浓度(mg/L);CK为空白培养基中吡嘧磺隆浓度(mg
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