有机污染物对水体真细菌群落结构的影响1

47卷2期微生物学报47(2):313～3182007年4月4日ActaMicrobiologicaSinica4April2007有机污染物对水体真细菌群落结构的影响赵阳国,任南琪3,王爱杰,万春黎(哈尔滨工业大学市政环境工程学院哈尔滨150090)摘要:为了揭示有机污染物对环境真细菌组成和多样性的影响,应用末端限制性片段长度多态性(tRFLP)和16SrDNA文库技术并结合水质分析方法,比较分析了松花江流域内受不同程度有机污染的4个水体及其沉积物中真细菌的群落结构。tRFLP分析表明各水体及底泥均呈现较为复杂的群落结构模式,不同底泥群落形成的末端限制性片段(TRF)图谱具有很高的相似性,但随着污染程度的加强,部分类群明显富集,而且在水样组和泥样组内,群落结构的相似性同水质相似性是一致的,主成分分析(PCA)显示水样和泥样中的真细菌TRF形成不同的群。16SrDNA文库分析表明松花江哈尔滨段底泥中真细菌分布于10个门,Proteobacteria门占优势,达群落总数的21192%(β2Proteobacteria亚门占10196%),而有机染污物严重超标的生活污水排污道底泥中的微生物多样性较低,分布于7个门,Proteobacteria门为优势群,占群落的47137%(α2Proteobacteria亚门占21105%δ,Pε2Proteobacteria亚门占15179%)。该研究表明向水体中长期排放高浓度有机物能使系统中微生物群落多样性降低,与污染物降解相关的功能微生物类群明显富集。关键词:有机污染物;真细菌群落;末端限制性片段长度多态性(tRFLP);16SrDNA文库中图分类号:Q939文献标识码:A文章编号:000126209(2007)0220313206随着人类活动范围不断扩大,越来越多的副产物被排放到自然生态系统中,作为主要分解者,微生[1]物群落受到了严重影响,尤其是化肥农药、放射性[2]、石油废物[3]和重金属[4～6]等污染物已经对自然微生物群落系统造成了破坏。所以,很有必要将微观世界中发生的真实图景展示给人们。在揭示微生物群落结构与动态过程中,分子生物学起到了重要推动作用。其中变性P温度梯度凝胶电泳(denaturingtemperaturegradientgelelectrophoresis,DTGGE)[7]、单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)[8]和末端限制性片段长度多态性(terminalrestrictionlengthfragmentP2P2polymorphism,tRLFP)[9]等分子指纹技术的应用最为广泛。由于tRFLP技术整合了自动测序仪的高分辨率和高通量特征,对分析复杂群落的结构较其它指纹技术具有明显优势,具有广阔的应用前景;对于该技术无法将特异条带进行测序分析及原位杂交的缺点,可以通过与克隆文库序列进行比较,或采用软件将多酶切的末端限制性片段(terminalrestrictionfragment,TRF)与现有数据库进行叠加比较的方式[10,11]加以弥补。(NucleoSpinR○采用水质分析与分子生物学技术相结合的策略,分析了松花江流域内受不同程度有机污染的4个水体及其沉积物中真细菌微生物群落结构特征,以及水质污染与微生物群落结构的取向关系。1材料和方法111主要试剂和仪器土壤DNA提取试剂盒PowerSoilDNAIsolationkit(Mobio,CAUSA);ExTaqDNA聚合酶、dNTP、pMD192T载体(TaKaRa公司);PCR引物(Invitrogen,上海);胶回收或柱式PCR产物回收试剂盒ExtractⅡ,Macherey2Nagel,Germany);内切酶MspⅠ、HhaⅠ和RsaⅠ(Fermentas,MDUSA);电泳系统PowerPac1000(Bio2Rad,CAUSA);紫外分光光度仪(BeckmanCoulterDU800,CAUSA);离子色谱(Optima5300DVICP2OES,PerkinElmer,MAUSA;TOC2VCSPCP,Shimadzu,Japan);GenScansizestandardROX1000、GeneAmpR○PCRsystem2700PCR仪、测序仪(AppliedBiosystems,CAUSA);测序仪377分析软件GenScan311(AppliedBiosystems,CAUSA);Sequencher510(GeneCodes,MIUSA);Phylip基金项目:国家“973项目”(2002AA001036);国家自然科学基金(50208006)3通讯作者。TelPFax:862451286282008;E2mail:[e-mail]作者简介:赵阳国(1975-),男,山东人,博士,从事废水处理与微生物分子生态学研究。E2mail:[e-mail]收稿日期:2006207231;接受日期:2006209222;修回日期:2006211213314ZHAOYang2guoetal.PActaMicrobiologicaSinica(2007)47(2)3165[12]、SPSS12(SPSSInc.,ILUSA)。112样品采集及水质分析方法样品采集于2005年11月6日,气温5℃左右,地点选择松花江流域内有机污染程度不同的4种水体(图1,采样点A～D),分别为生活污水排污沟(A),田间溪流(B),松花江支流拉林河(C),松花江干流哈尔滨段(D)。分别于4个地点收集20cm以下水样(简写为S1),沉积物表层样品(S2)和表层以下20cm的深层样品(S3)。12个样品收集时,各平行收集3份,混合后置于冰盒中保存,当日进行水质各项参数的测量以及样品总DNA的提取。水质参数主要检测了用于标志水体受有机污染的几项指标,包括化学需氧量(COD,重铬酸钾法[13]),总磷(TP)和总氮(TN)(离子色谱法[13])。图1样品采集地点在松花江流域的位置Fig.1Descriptionsofsamplingsites.Symbols(×○)showthesamplingsitesAtoD.113DNA提取和PCR扩增取100mL水样于10000×g离心(4℃,10min),收集沉淀,或称取0125～015mg污泥,采用土壤DNA提取试剂盒提取总DNA,最终溶解于100μL2mmolPLTrisHCl(pH80)。在构建16SrDNA文库和tRFLP分析时均采用真细菌16SrDNA保守引物:Eub8F[14]和Eub926R5′5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′CCGTCAATTCCTTTRAGTTT3[15],分别对应于E.coli21′22222216SrRNA的8～27bp和926～907bp。在tRFLP分析时,引物Eub28F的5′端采用62FAM进行荧光标记。PCR反应程序为:94℃40s,53℃40s,72℃1min,共30个循环。对于构建16SrDNA文库和tRFLP分析的PCR产物,分别采用胶回收或柱式PCR产物回收试剂盒进行纯化。最终均使用40μL2mmolPLTris2HCl(pH810)洗脱PCR产物。114构建16SrDNA文库和tRFLP分析将纯化的PCR产物连接于pMD192T载体中,采用氨苄和PCR法筛选阳性克隆,每个样品随机挑取100个阳性克隆进行测序。采用软件Sequencher510拼接测序结果并去掉载体污染。自GenBank中下载真细菌各门的序列,采用Phylip3165软件包以相邻法绘制真细菌系统进化树框架,根据文库序列在真细菌系统树框架中的位置,对各文库序列进行分类统计。分别采用内切酶MspⅠ,HhaⅠ和RsaⅠ消化纯化的PCR产物。取消化样品1μL加1μL含有内标ROX1000的上样缓冲液,于95℃变性后上样。采用415%的聚丙烯酰胺凝胶和1×TBE缓冲液,于基因测序仪中以3kV收集315h,片段的长度和浓度采用GenScan311进行分析,同时采用内切酶软件模拟酶切16SrDNA文库序列,将序列长度与GenScan分析结果进行对比,找出TRF所对应的细菌种属。采用SPSS12软件对MspⅠ产生的TRF图谱进行主成分分析(principalcomponentanalyses,PCA)[16]。2结果211各取样点水质分析COD、总磷和总氮是标识水体有机物污染程度的重要指标,中国《地表水环境质量标准GHZB121999》中规定适于集中供水的水体最低标准中COD须小于20mgPL,总磷小于011mgPL,总氮小于20165mgPL。根据图2,取样点A和B水样COD、总磷和总氮的含量均远远超过这一规定,尤其是A点水中含有较多黑色有机颗粒并伴有H2S气体味道,周围植物生长茂密;B点水质较混浊,没有气味,河道中长满芦苇和香蒲,A和B均含有未经处理的生活污水,水中含有大量的未降解有机质。河道A经B流入河流C中,水中的有机质经过沉淀、降解以及稀释,COD、总磷和总氮分别降至27mgPL,0112mgPL图2取样点水质分析结果Fig.2Analysisofwaterqualityfordifferentsamples.TP,totalphosphorus;TN,totalnitrogen.赵阳国等:有机污染物对水体真细菌群落结构的影响.微生物学报(2007)47(2)315和22mgL以下,已接近最低标准,在该位点水质澄对污泥样品AS3和DS3随机挑取克隆测序,拼清,底泥中以泥沙为主,呈灰白色。而取样点D为接后分别得到77和73条完整序列。采用哈尔滨市的主要饮用水水源,水体中COD、总磷和Sequencher50将相似性97%的序列归为同一个操总氮分别为24mgL,009mgL和26mgL,基本符合作分类单元(operationaltaxonomyunit,OTU),分别得集中供水标准。到50和70个OTU。以覆盖率(C)来评价构建的16S2216SrDNA文库分析底泥中微生物群落的组成rDNA文库对环境微生物多样性的体现,公式为:试剂盒提取的水样和泥样总DNA无色透明,产C=[1-n1N]]×100%率为50～200μgg泥样(湿重),OD280OD260=16～其中,N代表测序的克隆总数,n1代表OTU数20,浓度659～1549μgmL,片段约为23kb,无降解,量[17]。根据公式,计算文库序列对2个样品覆盖率无RNA污染。及可能的微生物种类见表1。表12个样品克隆文库序列分析Table1Comparisonof2groupsof16SrDNAclonelibrariesSamplesGenBankNosTotalsequencesTotalOTUCoveragerate%ProbabletotalspeciesAS3DQ088228～DQ0882737750351143DQ444158～DQ444188DS3DQ444081～DQ4441247370431698DQ463224～DQ463252从松花江哈尔滨段底泥(DS3)16SrDNA文库中Bacteroidetes占2763%,Firmicutes占1447%。得到的序列分布于10个已分类的门(图3),占群落23tRFLP对各样品微生物群落结构进行相似性比例较大的门分别为:Proteobacteria为219%(其中分析βProteobacteria占1096%,δεProteobacteria占12个样品的TRF图谱均得到30～50个条带,822%),Bacteroidetes1918%,DeinococcusThermus显示出较为复杂的多样性。将各泳道条带数字化,1781%,Acidobacteria占1501%,其余各门均在在同一迁移率下,有则计为1,无则计为0。主成分10%以下,且分布均匀。与之相比,排污沟底泥分析结果(图4)显示,水样中的微生物群落(S1)同(AS