菌悬液和菌片的制备

菌悬液和菌片的制备收藏转发2008-09-0815:39:23分类:个人日记浏览(727)评论(0)2.1.1.2.1适用范围制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。2.1.1.2.2试验器材（1）菌种:金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌ATCC16404。在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。（2）有机干扰物：见附录A。（3）磷酸盐缓冲液：见附录A。（4）无菌蒸馏水。（5）稀释液：见附录A。（6）细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）等，见附录A。（7）革兰染色液：见附录A。（8）芽孢染色液：见附录A。（9）恒温水浴箱。（10）玻璃漏斗。（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。（12）数字可调移液器（10μl，20μl，100μl，200μl，1000μl）及配套用一次性塑料吸头。（13）离心机。（14）电动混合器（15）浊度计。2.1.1.2.3细菌悬液制备程序（1）细菌繁殖体悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0ml～10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。2）取菌种第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用5.0ml吸管吸取3.0ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀。3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4）细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。（2）细菌芽孢悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5ml～10ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。2）用10.0ml吸管吸取5.0ml～10.0ml第3代～5代的18h～24h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养5d～7d。3）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达95%以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。改良芽孢染色法：①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃条件下，加热30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5%沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。4）罗氏瓶培养物，用10.0ml吸管加10.0ml无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0ml无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。5）必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中24h，使菌自溶断链，分散成单个芽孢。6）用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清除其中的琼脂凝块。7）将过滤后的芽孢悬液，置无菌离心管内，以3000r/min速度离心30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。8）将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。9）将芽孢液放于80℃水浴中10min（或60℃，30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。10）芽孢悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。11）怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。2.1.1.2.4菌片的制备程序（1）消毒试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。载体应根据消毒对象选择，常用的有金属、玻璃、滤纸、线、棉布等。根据其特点选择适宜材料载体作为代表。载体可以为方形，大小为10mm×10mm。当以金属片为载体时，因方形金属载体在振敲时可将玻璃试管撞碎，故改用12mm直径圆形金属片（厚0.5mm）。（2）所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：①将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30min；②以自来水洗净；③用蒸馏水煮沸10min；④用蒸馏水漂洗至pH呈中性；⑤晾干、熨平备用。（3）布片用白平纹棉布制作。在剪开前，先将脱脂的布块按载体规定的大小，抽去边缘一周的经纬纱各一根，再按抽纱痕剪开。此法制成的载体大小一致，且无毛边。金属片以不锈钢制作，纸片以新华滤纸制作。（4）载体经压力蒸汽灭菌后，使用滴染法染菌。染菌用菌悬液：使用TSB营养肉汤配制。细菌繁殖体，可直接使用经18h～24h培养的斜面培养物，细菌芽孢可使用4℃冰箱贮存液。含菌量约为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml，可使用浊度计调整菌液浓度。滴染法染菌时，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片为10μl。用10μl移液器接灭菌塑料吸头滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置37℃温箱内干燥（约20min～30min），或置室温下自然阴干后再使用。（5）每个菌片的回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为5×105cfu/片～5×106cfu/片。2.1.1.2.5注意事项（1）用浊度计测定的菌悬液浓度，只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计。作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告（如杀菌试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量），必须以活菌培养计数的实测结果为准，不得使用根据比浊法判定的估计值。（2）滴染时，菌液滴加量不宜过多，避免流散影响染菌的准确性。（3）细菌繁殖体在烤干过程中，可引起部分死亡，如铜绿假单胞菌在37℃干燥过程中，滴度最高可下降1个对数值。此时，应提高初始菌浓度，以便达到所需的菌量。（4）配制菌悬液和制备菌片时，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。（5）用带橡皮塞的容器保存菌液时，应将其预先煮沸10min进行脱硫处理。（6）制得的菌悬液和菌片，用毕应随时放入冰箱内，尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。