气相色谱法3

第六节定性与定量分析方法一、定性分析方法色谱定性分析是鉴定样品中各组分是何种化合物。用气相色谱法对范围未知的混合物单纯用气相色谱法定性则很困难。常需与化学分析或其它仪器分析方法配合。1.利用保留值定性(1)已知物对照法：根据同一种物质在同一根色谱柱上和相同的操作条件下保留值相同的原理进行定性。将适量的对照物质加入样品中，若加入后某色谱峰相对增高，则该组分与对照物可能为同一物质；再选一根与所用色谱柱极性差别较大的柱，再进行实验。若两根柱上该色谱峰都产生增高现象，一般可认定二者是同一物质。本法适用于组分已知的复方药和定型药物产品分析。(2)利用相对保留值定性：测定各组分的相对保留值，与文献数据对比进行定性。ris是待定性组分(i)与参考物质(s)的调整保留值之比，即：(20·34)由于分配系数只取决于组分的性质、柱温与固定液的性质，因而r；s与固定液的用量、柱长、载气流速及柱填充情况等无关。故气相色谱手册及文献都登载相对保留值。利用此法时，先查手册，根据手册规定的实验条件及参考物质进行实验。相对保留值定性法适用于所有组分已知的情况，也可与已知物对照法相结合，先用此法缩小范围，再用已知物进行对照。siR(s)R(i)R(s)R(i)''''kkVVttris(3)利用保留指数定性：许多手册上都刊载各种化合物的保留指数，只要固定液及柱温相同，就可以利用手册数据对物质进行定性。保留指数测定的重复性及准确性均较好(相对误差l％)，是色谱定性的重要方法。保留指数与物质结构及色谱柱固定相的关系，可参见有关书籍。2.利用化学反应定性把由色谱柱流出的待鉴定组分(馏分)通入官能团分类试剂中，观察是否发生反应(显色或产生沉淀)，判断该组分含什么官能团或属何类化合物。例如，鉴定醛、酮可用2,4－二硝基苯肼试剂。若产生橙色沉淀，则说明组分为l~8个碳原子的酮或醛。检查各类官能团的试剂及配制方法可参考有关参考书。若用热导检测器，可在组分开始起峰时将尾气直接通入装有官能团分类试剂的试管中，待该峰将出完时，观察试剂是否反应。若用氢火焰检测器必须在色谱柱及检测器间装上柱后分流阀，接收组分。因为样品在氢焰中被破坏，不能直接用尾气检查。3.利用联用技术（hyphenatedtechniques)定性把气相色谱仪作为分离手段，把质谱仪、红外分光光度计等充当检测器，称为色谱一光谱联用，简称两谱联用。联用方式有两种：在线联用（on-linecoupling）是把色谱分离后的组分峰直接导入质谱等分析；以及非在线联用(off-linecoupling)是分别收集气相色谱分离后的各纯组分，而后用光谱仪器测定它们的光谱，进行定性。目前比较成熟的在线联用仪有：(l)气相色谱一质谱联用仪(GC－MS)：由于质谱的灵敏度高(需样量仅10-11~10-8g)、扫描时间快(0～1000质量数，扫描时间可短于1s)，并能准确测定未知物的分子量，给出许多结构信息。因此，气相色谱一质谱联用是目前最成功的联用仪器。它在获得色谱图的同时，可得到对应于每个色谱峰的质谱图。根据质谱对每个色谱组分进行定性。GC－MS示意图见下图。图20－19GC－MS联用仪示意图(2)气相色谱红外光谱联用：傅里叶变换红外分光光度计(FouriertransforminfraredspectrographFTIR)扫描速度快(全波数扫描0.l至几秒)，灵敏度高(信号可累加)，而且红外吸收光谱的特征性强，因此气相色谱一傅里叶变换红外联用仪(GCFTIR)也是一种很好的联用仪器，能对组分进行定性鉴定。但其灵敏度与图谱自动检索还不如GCMS。二、定量分析方法气相色谱定量分析具有快速、灵敏、简便、定量准确度高、精密度好的特点。定量分析的依据是在实验条件恒定时峰面积与组分的量成正比，即Wi=fi’／Ai。因此，必须准确测量峰面积和比例常数fI’(称为校正因子)。在各种操作条件(色谱柱、温度、流速等)不变时，在一定进样范围内，色谱峰的半峰宽与进样量无关。因此正常峰也可用峰高代替峰面积求含量。(一)峰面积的计算峰面积测量的准确度直接影响定量结果，不同峰形的色谱峰必须采用不同的测量方法，才能得到较准确的结果。1.峰高乘半峰宽法正常色谱峰面积计算式：A＝l.065hW1/2(20·34)用读数显微镜测量半峰宽，测量误差可在l％以下。2.峰高乘平均峰宽法对不对称峰，用平均峰宽代替半峰宽，计算结果较准确。平均峰宽即峰高0.15倍和0.85倍处的峰宽的平均值。A=1.065h(W0.15+W0.85)／2(20·35)3.自动求积法目前的气相色谱仪都带有数据处理机或色谱工作站，能自动打印或显示出峰面积(一般为mV·s)及峰高。这类仪器测量的准确度高(RSD为0.2％～l％)，线性范围宽(＞105)，操作简便，而且可根据峰形确定切割方式与基线处理方法。(二)定量校正因子色谱定量分析的依据是被测组分量与检测器的响应信号(峰面积或峰高)成正比。但相同量的不同物质常产生不同值的峰面积或峰高。这样，各组分峰面积或峰高的相对百分数并不等于样品中各组分的百分含量。因此引入定量校正因子，将各峰面积或峰高校正以定量代表物质的量。1.定量校正因子的定义定量校正因子分为绝对定量校正因子和相对定量校正因子。由上述峰面积与物质量之间的关系Wi=f’iAi可知：f’i=Wi/Ai(20·36)f’i称为绝对定量校正因子，即单位峰面积所代表的物质量。这是以峰面积表示的定量校正因子，也可以用峰高来表示定量校正因子。此外，也有用它们的倒数来表示的，简称为响应值。绝对定量校正因子的值随色谱实验条件而改变，因而很少使用。在实际工作中一般采用相对校正因子。其定义为某物质i与所选定的基准物质s的绝对定量校正因子之比，即：(20·37)上式中W以重量表示，因此fw又称为相对重量校正因子，通常称为校正因子(f)。本书均使用重量校正因子。如果物质量用摩尔表示，则称为相对摩尔校正因子，即(20·38)fwi和fmi都是无因次量，二者间的关系如下：(20·39)siisssiiwswiwi''WAWAAWAWfffsiisssiimsmimi''mAmAAmAmfffsiwissiiismi//mmfmWAmWAf2.定量校正因子的测定气相色谱的定量校正因子常可以从手册和文献查到。但是有些物质的校正因子需要自己测定。测定时，准确称取待测校正因子的物质i(纯品)和所选定的基准物质s，混合均匀后进样，测得两色谱峰面积Ai和As，用式(20·37)求得物质i的相对重量校正因子。显然，选择不同的基准物质测得的校正因子数值不同。如采用归一化法定量时，选择样品中某一组分为基准物质。测定校正因子的条件(检测器类型)应与定量分析的条件相同。还应该注意的是，使用热导检测器时，以氢气或氦气作载气测得的校正因子相差不超过3％，可以通用，但以氮气作载气测得的校正因子与前二者相差很大，不能通用。而氢焰检测器的校正因子与载气性质无关。(三)定量方法气相色谱定量方法分为归一化法、外标法、内标法、内标对比法及叠加法等。1.归一化法(normalizationmethod)如果样品中所有组分都能产生信号，得到相应的色谱峰，那么可以用如下归一化公式计算各组分的含量。(20·40)若样品中各组分校正因子相近，可将它们消去，直接用峰面积归一化法计算。%100%100iiiinn332211iiifAfAfAfAfAfAfAC中国药典用不加校正因子的面积归一化法测定药物中各杂质及杂质总量的限度。(20·41)表20－4列出了分离某醇类混合物，用氢焰检测器检测，测得的数据用校正面积归一化法与面积归一化法两种方法计算得到的各种醇的百分含量。由表可见由校正与未校正的面积归一化计算所得的百分含量差别很大。归一化法的优点是：简便、准确、定量结果与进样量重复性无关(在色谱柱不超载的范围内)、操作条件略有变化时对结果影响较小。缺点是：必须所有组分在一个分析周期内都流出色谱柱，而且检测器对它们都产生信号。不适于微量杂质的含量测定。%100%n321iiAAAAAC2.外标法(externalstandardization)用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法•工作曲线法用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算。工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。•外标一点法用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：Wi=Ai(Wi)s/(Ai)s(20·42)式中Wi与Ai分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。(Wi)s及(Ai)s分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。3.内标法选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液内，以待测组分和对照物质的响应信号比，测定待测组分含量的方法称为内标法。该对照物质称为内标物。在一个分析周期内不是所有组分都能流出色谱柱(如有难气化组分)，或检测器不能对每个组分都产生信号，或只需测定混合物中某几个组分的含量时，可采用内标法。准确称量W克样品，再准确称量Ws克内标物，加至样品中，混匀，进样。测量待测组分i的峰面积Ai及内标物的峰面积As，则i组分在W克样品中所含的重量Wi，与内标物的重量Ws，有下述关系：(20·42)ssiisifAfAWW待测组分i在样品中的百分含量Ci％为：(20·44)对内标物的要求：①内标物是原样品中不含有的组分②内标物的tR应与待测组分相近，但能完全分离(R＞1.5)③内标物必须是纯度合乎要求的纯物质。内标法的优点是：①在色谱柱不超载的范围内，定量结果与进样量重复性无关②只要被测组分及内标物出峰，且分离度合要求，就可定量，③很适用于测定药物中微量有效成分或杂质的含量。由于杂质(或微量组分)与主要成分含量相差悬殊，无法用归一化法测定含量，用内标法则很方便。但样品配制比较麻烦和内标物不易找寻是其缺点。%100%isssiiiWWfAfAC4.内标对比法(已知浓度样品对照法)在药物分析中，校正因子多是未知的，这时可用内标对比法进行定量。先配制待测组分i的已知浓度的对照品溶液，加入一定量的内标物s(相当于测定校正因子)；再将内标物按相同量加入至同体积样品溶液中，分别进样，由下式计算样品溶液中待测组分的含量。(20·45)对于正常峰，可用峰高h代替峰面积A计算含量(20·46)对照样品对照样品iisisiCCAAAA对照对照样品样品isisiiCAAAAC对照对照样品样品isisiiChhhhC第七节应用与示例气相色谱法在药物分析中的应用很广泛，包括药物的含量测定、杂质检查及微量水分、残留溶媒测定、药物中间体的监控(反应程度的监控)、中药成分研究、制剂分析(制剂稳定性和生物利用度研究)、治疗药物监测和药物代谢研究等。一、合成药物分析药物合成过程中往往产生各种中间体，因此，合成药物的质量控制在测定产物含量的同时，需要控制其中间产物。气相色谱法能分离药物及其中间体，并进行定量测定。例萘丁美酮的含量测东及其中间体的控制(李平、宁雅君，药物分析杂志.1993，13(2)：96)。看教科书二、中药成分研究中药的成分复杂，而中成药一般都是多种药材的混合物，它们的成分研究比较困难。但气相色谱法在这方面仍然是一